Unité des Aspergillus

Recherches

Sujets de recherches et travaux de l'Unité

Introduction  

Les mycoses invasives comptent parmi les pathologies infectieuses les plus graves en santé humaine. Leur émergence résulte à la fois de l'augmentation du nombre de patients immunodéprimés et de la plus grande agressivité des traitements immunosuppresseurs en usage à l'hôpital..
Deux germes sont essentiellement responsables de ces infections, Candida et Aspergillus.
Les aspergilloses invasives représentent aujourd'hui la seconde cause de mortalité par infection fongique à l'hôpital. En onco-hématologie, la situation chez les allogreffés de moelle est préoccupante avec une fréquence au moins égale à 10 % et une mortalité proche de 100 %.
Cette mortalité élevée résulte d'un diagnostic très difficile et le plus souvent trop tardif. D'autre part, le traitement se résume à l'emploi quasi exclusif de l'amphotéricine B dont les effets toxiques secondaires sont importants. Enfin, la physiopathologie de la maladie, est encore très mal connue.

D'un point de vue économique, le traitement de l'aspergillose invasive est extrêmement onéreux : 40 % des 2,5 milliards de $ consacrés en 1997 au traitement les mycoses invasives sont réservés à l'achat de l'amphotéricine B et de l'itraconazole, antifongiques employés contre l'aspergillose invasive. En outre, les aspergilloses invasives surviennent généralement alors que le patient évolue vers la rémission de sa pathologie sous-jacente ou lors d'une corticothérapie destinée à contrôler certaines complications de greffe. Il s'agit donc d'une complication tardive qui constitue une lourde charge humaine et financière.

L'organisme responsable de la majorité des infections aspergillaires est Aspergillus fumigatus. Ce champignon est un saprophyte jouant un rôle important dans le recyclage naturel du carbone et de l'azote organique. Ses caractéristiques biologiques majeures (thermopreferendum de large gamme, capacité de sporulation élevée et absence de besoins nutritionnels spécifiques) lui permettent de coloniser une grande variété de substrats. Ses conidies, présentes dans l'air de tous les environnements, sont régulièrement inhalées par l'homme et leur petite taille (2-3 microns) leur permet de pénétrer le tractus respiratoire jusqu'aux alvéoles pulmonaires.

Chez l'hôte immunocompétent, les défenses cellulaires non-spécifiques éliminent le champignon. Chez le patient immunodéprimé, l'inefficacité de la réponse cellulaire se traduit par la germination des conidies et une expansion mycélienne dans le parenchyme pulmonaire, provoquant une pneumopathie sévère associée ou non à l'envahissement d'autres organes.

Objectifs  

Les recherches développées dans notre groupe sur A. fumigatus sont axées sur deux thèmes majeurs.

Le premier, d'orientation médicale, est l'étude de l'aspergillose invasive. Les recherches portent aujourd'hui sur l'étude biochimique et moléculaire de facteurs potentiels de virulence et la compréhension de la réponse immunitaire innée, qui joue un rôle majeur dans le contrôle de A. fumigatus chez l'hôte immunocompétent, et qui est déficiente chez l'hôte immunodéprimé.
Le second thème, de nature fondamentale, concerne l'étude des phénomènes biochimiques et génétiques associés au développement du stade mycélium dont l'initiation et l'extension apicale sont parmi les problèmes biologiques majeurs dans l'étude de tous les champignons filamenteux. A l'intérieur de ce thème, la biosynthèse et l'organisation structurale de la paroi du mycélium et des conidies sont particulièrement étudiées. Ces recherches pourraient aboutir à l'identification de voies métaboliques spécifiques, essentielles au développement d' Aspergillus et qui pourraient devenir des cibles potentielles pour de nouveaux antifongiques

Principaux résultats acquis  

Le Laboratoire des Aspergillus a été créé en 1995. Il est devenu Unité en 2000. Les principaux résultats déjà obtenus sont les suivants:

Identification et analyse moléculaire de séquences répétées d'A. fumigatus (rétrotransposons inactifs) utilisables pour le typage des souches de cette espèce.
Première étude à grande échelle de typage moléculaire de cette espèce montrant sa grande diversité génétique et le caractère nosocomial des infections.
Participation à la mise au point du premier kit ELISA commercialisé pour le diagnostic sérologique de l'aspergillose invasive, fondé sur la détection de l'antigène circulant, le galactomannane.
Caractérisation moléculaire des antigènes majeurs de A. fumigatus et mise en évidence d'une activité dipeptidylpeptidase d'un type nouveau (DPPV).
Clonage et disruption d'une centaine de gènes codant pour des facteurs potentiels de virulence de A. fumigatus.
Mise en évidence de l'internalisation de conidies par l'épithélium pulmonaire.
Mise en évidence des mécanismes impliqués dans la phagocytose et le "killing" des conidies par le macrophage alvéolaire.
Induction d'une immunoprotection ouvrant la voie à une possible "vaccination" des patients immunodéprimés contre cette infection.
Identification du réseau tridimensionnel polysaccharidique responsable de la structuration de la paroi cellulaire avec la mise en évidence du rôle central des beta(1-3)glucanes branchés dans cette organisation et l'identification d'un beta(1-3/1-4)glucane jamais décrit chez les champignons d'un lipogalactomannane et d'un galactosaminoglalactane.
Analyse des gènes responsables de la biosynthèse des alpha et beta(1-3)glucanes pariétaux et de l'expansion pariétale au cours de la croissance du champignon.
Recherche des PAMPS (pathogen associated molecular pattern) spécifiques d'A. fumigatus stimulant ou inhibant la reconnaissance par les macrophages et les cellules dentritiques.
Caractérisation des biofilms à Aspergillus fumigatus.
Etablissement du plus grand catalogue d'enzymes intervenant dans la modification post-synthétique des beta(1-3) glucanes, avec notamment la mise en évidence d'une famille de beta(1-3) glucanosyltransferases nouvelle pour la science, ayant un rôle essentiel dans la morphogenèse fongique.
Etude du rôle enzymatique de protéines à ancre glycosylphosphatidyl inositol dans la biosynthèse de la paroi fongique.

 Travaux de recherche

I - La paroi cellulaire

Chez A. fumigatus, comme dans d'autres champignons pathogènes, la paroi cellulaire est essentielle pour la croissance fongique et pour la résistance du champignon aux aggressions externes telles que les réactions de défence de l’hôte. La paroi cellulaire d'A. fumigatus se compose exclusivement de polysaccharides. Le squelette fibrillaire de la paroi d'A.fumigatus se compose fondamentalement d’un complexe glucane-chitine, incorporé dans un ciment amorphe composé de chaînes linéaires du α (1-3) (1-4) glucane associé à du galactomannane. Ces deux polysaccharides sont également des composants importants de la matrice extracellulaire qui maintiennent des hyphae associés en biofilm. Ce biofilm favorise la croissance et augmente la résistance aux molécules antifungiques. L'organisation du réseau tridimensionnel des polysaccharides responsables de la rigidité de la paroi cellulaire est un processus enzymatique très complexe et séquentiel. Les enzymes impliquées dans la biosynthèse des N et O-mannanes, des α et β1-3 glucanes, de la chitine et du galactane ont été analysées utilisant des approches genomiques et biochimiques. Les enzymes qui sont responsables du branchement des polysaccharides entre eux sont également étudiées, particulièrement parmi des protéines ancrées à la membrane de plasma par une partie de glycosylphosphatidylinositol.

Différentes activités enzymatiques
associées à la paroi fongique

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II - Interaction hôte-A. fumigatus

Les macrophages et cellules dendritiques sont les cellules de l’hôte qui opèrent en première ligne de la réponse innée. Le système immunitaire inné, commun à tous les animaux dont l’homme, permet de détecter les micro-organismes grâce à une famille de récepteurs récemment caractérisés, les récepteurs pattern recognition receptors ou PRRs. Ces récepteurs contrôlent l’expression de molécules qui vont s’opposer aux agents infectieux. Ils sont activés par des motifs moléculaires conservés au sein de différents types de micro-organismes baptisés PAMPs (pathogen associated molecular pattern).

Perspectives

Projets de recherche de l'Unité 
 

Etude des interactions hôte / Aspergillus fumigatus avec notamment l'analyse de la réponse immunitaire cellulaire innée (macrophages) et induite (lymphocytes B et T) et la poursuite de l'analyse de la virulence par l'identification de gènes uniques à A. fumigatus et/ou différentiellement exprimés in vivo.

Analyse de la structure de la paroi des conidies et du mycelium. Un effort tout particulier est dirigé vers l'étude des enzymes intervenant dans la biosynthèse et l'élaboration du réseau tridimensionnel des polysaccharides de la paroi mycélienne.

Aux techniques de biologie moléculaire et cellulaire et de biochimie déjà utilisées au laboratoire, s'ajoutent désormais des méthodologies d'étude biologique à grand échelle (protéome, transcriptome, génomique comparative) qui, associées au séquençage du génome de A. fumigatus permettront de grandes avancées dans la connaissance de A. fumigatus, qui est aujourd'hui le pathogène fongique aérien le plus répandu et le plus grave dans les pays industrialisés.

Cette nécessité d'une approche multidisciplinaire pour obtenir une meilleure compréhension de la biologie d'Aspergillus fumigatus entraîne une organisation transversale de plusieurs programmes de recherche gravitant autour de notre laboratoire notamment dans les domaines de génomique / biochimie structurale et d'immunologie. Un des atouts de notre laboratoire est aussi le réseau de collaborations effectives et fructueuses avec de nombreuses équipes françaises et étrangères et le support efficace de partenaires industriels dans les domaines de l'antibiothérapie (Aventis, Novexel) du diagnostic (Bio-Rad) ou de l'environnement (Suez).

L'Unité des Aspergillus est aujourd'hui un des plus grands laboratoires au monde dédié à Aspergillus fumigatus. Il est reconnu internationalement comme l'attestent ses publications et les nombreuses invitations faites à ses membres pour présenter leurs résultats à des conférences internationales. Les projets proposés devraient lui permettre de maintenir l'excellence scientifique et le leadership du laboratoire dans des domaines originaux et porteurs pour A. fumigatus, mais qui pourraient, pour la plupart, être facilement étendus à l'étude de l'autre pathogène fongique le plus important en santé humaine, Candida albicans.

Protocoles

I - Mode oppératoire des techniques les plus utilisées au laboratoire

Extraction d'ADN génomique d'A. fumigatus :

L’ADN fongique est extrait par la méthode décrite par Girardin et al. (1993). Les conidies sont mises en culture dans du milieu Sabouraud en boîtes de pétri, sans agitation, et incubées une nuit à 37°C. Le mycélium est filtré, séché puis resuspendu dans 800µl de tampon d’extraction (Tris 20mM, NaCl 250mM, EDTA 25mM pH 8, SDS 1%) et de 8µl de protéinase K (10mg/ml, Roche). Le mycélium est ensuite broyé à l’aide de billes de verre (0,5mM, BIOSPEC PRODUCTS) dans un Fastprep (MP Bio) 3 fois pendant 45s (v=4.5m/s). Après broyage, le mélange est incubé 10min à 65°C puis centrifugé pendant 1h à 11000g en présence de 600µl de phénol et 200µl de chloroforme. La phase aqueuse est ensuite incubée 3h à 37°C en présence de 8µl de RNase A (10mg/ml, Roche), puis centrifugée 10min à 3000g à 20°C en présence de 900µl de chloroforme. L’ADN est précipité avec 40µl de NaCl 4M, 900µl d’Isopropanol et lavé à l’éthanol à 70%. L’ADN génomique est repris dans 50µl de Tris EDTA (Tris 10mM, EDTA 1mM) pH 7.5 et conservé à 4°C.

Construction de cassette de déletion par PCR fusion :

Les cassettes de délétion sont effectuées par la méthode de PCR fusion débutant par une première PCR (Figure) permettant d’amplifier les trois parties de la cassette: la région flanquante 1 (amplicon 1, amorces A et B) et la région flanquante 2 (amplicon 3, amorces E et F) du gène cible à partir de l’ADN génomique de la souche sauvage, et le marqueur de sélection (amplicon 2, amorces C et D) à partir de l’ADN plasmidique, correspondant au gène de résistance. Les amorces de 50pb B, C, D et E sont des séquences chimères qui contiennent à l’extrémité 5’ une séquence inverse complémentaire (B avec C et D avec E) permettant la fusion. Les trois produits obtenus par PCR (10s à 95°C, 30s à 65°C, 30s par kb à 72°C) avec la Taq Fusion hight-Fidelity DNA Polymerase (Finnzymes) ont été purifiés avec le kit NucleoSpin Extract II (Macherey Nalgen) puis utilisés pour une seconde PCR. Cette dernière PCR permet la fusion des trois fragments à l’aide des oligonucléotides extérieurs A et F (Figure). 6 fois 50µL de cette dernière PCR sont nécessaire pour avoir au moins 1µg de cassette de délétion.

Transformation d'A. fumigatus par électroporation :

La cassette de délétion obtenue par PCR fusion a été utilisée pour transformer des conidies d’A. fumigatus par la méthode décrite par Sanchez and Aguirre (1996) avec les modifications suivantes : les conidies de la souche à transformer sont récupérées après six jours de culture en tube sur milieu Malt à 25°C dans de l’eau tweenée 0,05% permettant de resuspendre les conidies hydrophobes. Elles sont lavées cinq fois avec de l’eau et comptées sur cellule de Malassez. 1.10^9 conidies sont inoculées dans 125ml de milieu YG et incubées à 37°C à 300rpm pendant quatre heures. Les conidies sont ensuite récupérées par centrifugation, lavées à l’eau, resuspendues dans 12,5ml de milieu YEG et incubées pendant une heure à 30°C à 100rpm. Les conidies sont centrifugées et resuspendues dans 1ml de Sorbitol 1M maintenu dans la glace. La cassette de délétion (1 à 2 µg) est ajoutée à 50µl de suspension de conidies et le mélange est incubé 15min sur la glace, puis transféré dans une cuve d’électroporation 0,1cm (Bio-Rad). L’électroporation est réalisée en utilisant un électroporateur (Gene Pulser Xcell, Bio-Rad) avec les paramètres suivants : voltage 1kV, ampérage 25µF, résistance 400O. 1ml de YG froid est ajouté directement dans la cuve après l’électroporation puis les conidies sont transférées dans un tube stérile de 10ml et incubées sur la glace pendant 15min. Les tubes sont ensuite incubés à 30°C 100rpm pendant 1h30. Les conidies sont étalées sur milieu minimum (500µl/boite) et incubées à 20°C pendant la nuit. Le marqueur de sélection est ajoutée le lendemain en surcouche dans 3mL de milieu minimum contenant 0,7% agarose puis les boîtes sont incubées à 37°C. Les transformants sont ensuite isolés par repiquage sur Malt-Marqueur de sélection, puis sur Malt pour la conservation.                                                                                          

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Southern blot :

Le remplacement du gène d’intérêt par la cassette de délétion dans le génome des transformants est vérifié par southern blot. Pour cela, les ADN génomiques (1 à 1,5µg) extraits des transformants sont digérés pendant une nuit par une enzyme de restriction puis mis à migrer sur un gel d’agarose 0,7%. Après migration, le gel est incubé dans un bain d’HCL 0,25N, sous agitation lente, pendant 20 min. Le transfert des ADN sur la membrane de nylon (Hybond XL, GE Healthcare) se fait via du NaOH 0,4N pendant une nuit suivant un montage réalisé avec une éponge imbibée de NaOH 0,4N, du papier whatman 3M, le gel d’agarose retourné, la membrane de nylon, du papier whatman 3M puis du papier absorbants et un poids permettant le transfert par capillarité. La membrane est rincée avec du SSC 2X, puis hybridée avec la sonde préalablement dénaturée (100°C pendant 5min) et du tampon Dig Easy Hyb (Roche) pendant une nuit à 42°C (en rotation). La sonde est fabriquée par PCR à l’aide du PCR DIG Probe Synthesis Kit de Roche, avec les recommandations du fabriquant. La membrane est ensuite lavée successivement avec du tampon à faible stringence (2 fois 5min à température ambiante) et du tampon à forte stringence (2 fois 15min à 65°C). Les sites d'interaction non spécifique pouvant interagir avec l’anticorps anti-DIG sont bloqués à l’aide de la solution de bloquage pendant 30min. La solution d’anticorps anti-DIG est alors ajoutée et incubée pendant 30min. La membrane est lavée 2 fois 15min avec du tampon de lavage, et placée dans une pochette d’hybridation avec 2mL de tampon de détection et du CSPD au 1/100: substrat de la phosphatase alkaline présent sur l’anticorps anti-DIG permettant le détection par chimioluminescence (incubation 10min à 37°C). La membrane est placée dans une cassette au contact d’un film autoradiographique (Amersham HyperfilmTMMP) pendant 15 à 25 minutes, puis le film est développé.

II - Composition des milieux de culture d'A. fumigatus

Malt 2% :

- Malt extract                        20 g/l
- Distilled water                    1 L

RPMI :

- Poudre RPMI (Sigma)        10,4 g/l
- L-glutamine                          0,3 g/l
- MOPS pH7                           34,5 g/l
- Distilled water                      1 L

Brian :

• Milieu de base :

            - NH4NO3                              2,4  g/l
            - KH2PO4                               10 g/l
            - Asparagine                          10 g/l
            - MgSO4, 7 H2O                    2 g/l
            - Glucose                                50 g/l
            - Distilled water                     1 L

For solid medium, add:

            - Agar – agar                         20 g/l

Adjust to pH 5.4

• Solution A : (se conserve à -20°C)

            - ZnSO4, 7 H2O                     20 g/l
            - CuSO4, 5 H2O                     2 g/l
            - CO(NO3), 6 H2O                 1 g/l
            - Distilled water                     1 L

• Solution B : (se conserve à -20°C)

            - CaCl2                                    50 g
            - Distilled water                     1 L

• Milieu final :

            - Base medium                        1 L
            - Solution A                            1,3 ml
            - Solution B                             1,3 ml

Sabouraud :

- Glucose                                20 g/l
- Mycopeptone                     10 g/l
- Distilled water                     1 L

YG :

- Yeast extract                         10 g/l
- Glucose                                  10 g/l
- Distilled water                       1 L

YED :

- Yeast extract                          10 g/l
- Glucose                                  10 g/l
- Hepes (20 mM) pH8             4,8 g/L
- Distilled water                        1 L

2YTG :

- Bactotryptone                        16 g/l
- Bacto yeast extract               10 g/l
- NaCl pH7,2                              5 g/l
- Glucose                                   2 g/l

LB :