> Pathogénie microbienne moléculaire - INSERM U389
• Résumé
• Objectifs
• Génétique
• Biologie Cellulaire
• Inflammation
• Immunologie
• Vaccins
MISE EN PLACE D’UN MODELE D’ANALYSE DE L’INVASION BACTERIENNE
PAR L’INTEGRATION DE LA GENETIQUE MOLECULAIRE
ET DE LA BIOLOGIE CELLULAIRE ET DECISIONS STRATEGIQUES
CONCERNANT LE DEVELOPPEMENT DE VACCINS (1979-1989).
Les bactéries invasives récapitulent un programme complexe d’interactions avec les cellules eucaryotes. Elles sont donc de bonnes candidates pour déchiffrer les bases moléculaires d’étapes complexes comme l’entrée dans les cellules, la survie et la croissance intracellulaire, la destruction finale de la cellule hôte, etc... Shigella fût sélectionnée il y a environ 20 ans comme modèle de rupture, d’invasion et de destruction inflammatoire de l’épithélium intestinal.
De 1979 à 1981, le travail réalisé par Philippe Sansonetti à l’Institut Pasteur dans le groupe de Léon Le Minor, puis au Walter Reed Army Institute of Research (Washington DC), dans le groupe de Samuel Formal, a permis de démontrer que le pouvoir invasif de Shigella était codé par un grand plasmide de virulence d’environ 220 kb ( , , ). Sur cette base, grâce à une combinaison de transferts conjugatifs impliquant le plasmide de virulence de Shigella flexneri 5a (pWR100) puis, par conjugaison interrompue, le transfert successif de fragments de son chromosome, une souche réceptrice avirulente d’Escherichia coli K12 a pu être rendue totalement pathogène, lui conférant, étape par étape, l’ensemble des attributs de l’invasivité in vitro puis in vivo de Shigella ( ). Ce travail pionnier en matière de génomique des pathogènes demeure la base des travaux actuels et a orienté la réflexion qui a amené à la mise au point d’un vaccin vivant atténué de première génération contre la shigellose.
En 1985, Listeria monocytogenes fut introduite afin de développer, avec une bactérie à Gram positif, un modèle d’infection cérébrale faisant pendant au modèle d’invasion de la barrière intestinale par une bactérie à Gram négatif. comme Shigella. Parallèlement à l’inactivation et au clonage des gènes de Shigella impliqués dans l’invasion des cellules épithéliales ( ) et à l’identification de virR, le gène chromosomique contrôlant l’expression de ces gènes d’invasion en fonction de la température ( ), la première mutagénèse par transposition de L. monocytogenes a été effectuée, démontrant le rôle crucial de la Listériolysine O (LLO) dans la pathogénèse de la maladie ( ), plus particulièrement dans la capacité de la bactérie de se multiplier dans les cellules épithéliales infectées ( ) et d’induire une immunité protectrice chez la souris ( ).
Ces études ont représenté une forte incitation à analyser de façon plus détaillée la biologie de la cellule infectée et ont de ce fait poussé au développement de modèles cellulaires de plus en plus sophistiqués ainsi qu’à l’application de méthodologies d’imagerie complexe, telles la microscopie confocale et la vidéo-microscopie. Ceci conduisit tout naturellement à fusionner microbiologie moléculaire et biologie cellulaire dans ce qui est devenu la microbiologie cellulaire.
L’application de ces techniques de biologie cellulaire a permis de montrer que ces pathogènes avaient la capacité de remodeler le cytosquelette cellulaire afin d’induire leur entrée dans des cellules naturellement non-phagocytaires ( ). De plus, Shigella et L.monocytogenes ont été montrées capables de lyser leur vacuole de phagocytose et d’accéder ainsi au cytoplasme ( , ). Suite à cet échappement dans le cytoplasme, il a été pour la première fois montré que Shigella était douée d’une capacité de motilité intracellulaire et de passage de cellule à cellule, grâce à un mécanisme dépendant de la polymérisation de l’actine (Sansonetti, FASEB Conference on Molecular Mechanisms of Infection, Copper Mountain, 1988, ). IcsA, une protéine de membrane externe est responsable de ce mouvement dépendant de l’actine chez Shigella. Un phénomène similaire fut démontré chez L.monocytogenes ( ). Ces études furent parmi celles qui stimulèrent la communauté microbiologique et de biologie cellulaire à collaborer dans le but d’identifier et d’analyser des effecteurs bactériens et des cibles cellulaires dont l’interaction amène à des remaniements du cytosquelette des cellules de mammifères.
Sur la base des études décrites ci-dessus et qui furent résumées dans une revue en 1991 ( ), dès 1987, il apparut que le gène icsA qui code pour un phénotype très efficace de passage de cellule à cellule pouvait représenter la mutation “centrale” d’un processus rationnel d’atténuation de la pathogénicité de Shigella dans le but de développer un candidat vaccin oral de virulence atténuée. Deux souches candidates correspondant aux espèces/sérotypes les plus fréquents dans les régions endémiques furent alors construites chez S.flexneri 2a et S.dysenteriae 1. En plus de la mutation icsA, des délétions ont été introduites dans les gènes codant pour les systèmes de captation du Fe3+ (aérobactine: iuc iut pour S.flexneri et entérochéline: ent fep pour S.dysenteriae 1), de manière à ralentir la croissance des bactéries invasives au sein des tissus ( ). StxA, le gène codant pour la sous-unité catalytique de la toxine dysentérique, une puissante cytotoxine exclusivement produite par S.dysenteriae 1, a aussi été délété. Afin de tester a tolérance et l’immunogénicité de ces souches candidates vaccinales, des modèles animaux d’infection ont été développés et standardisés, en particulier chez le singe macaque rhésus. Cet animal développe un syndrome dysentérique identique à l’homme. L’utilisation de ce modèle a permis de valider la stratégie choisie de construction vaccinale en y démontrant atténuation et capacité de protection contre un challenge par la souche sauvage homologue ( ). Ce modèle simien a aussi permis d’anticiper que l’étude du développement des processus infectieux à l’échelon des tissus allait connaître un fort développement, indiquant que suite à la microbiologie cellulaire, la microbiologie tissulaire allait devoir être prise en compte.
Dès lors, toutes les approches ont comporté un volet in vitro et un volet in vivo. Cette forte pression à aller in vivo fût encouragée par deux découvertes faites dans le contexte de ce modèle simien: (i) la démonstration que la toxine dysentérique est essentiellement une cytotoxine dont le tropisme vasculaire conduit à la destruction des capillaires de la muqueuse intestinale, ajoutant de ce fait une composante de colite ischémique à la maladie invasive proprement dite et expliquant la gravité habituelle de la dysenterie causée par le bacille de Shiga ( ); et la démonstration que l’épithélium folliculaire (FAE) qui recouvre les follicules lymphoïdes muqueux, centres inducteurs de l’immunité muqueuse, représentent les sites d’entrée de Shigella dans la muqueuse intestinale ( ).