Unité des
Membranes Bactériennes
Institut Pasteur
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I - Systèmes d'acquisition de l'hème dépendant d'hémophores
(Sylvie Létoffé, Philippe Delepelaire, Francis Biville, Annick Paquelin, Frédéric Huché et Hélène Cwerman)

Le fer, quoique très abondant, n'en est pas moins l'objet d'une guerre acharnée entre les organismes vivants, tous ayant des systèmes plus ou moins sophistiqués pour le solubiliser et le séquestrer. Le succès de l'infection et de la colonisation d'un hôte par un pathogène bactérien dépend donc pour beaucoup de l'issue de cette compétition pour le fer. L'étude des mécanismes d'appropriation du fer par les pathogènes bactériens est en plein essor dans de nombreux laboratoires dans l'espoir de disséquer des étapes vulnérables du processus infectieux et de mettre au point de nouvelles drogues anti-bactériennes.

Il est actuellement bien établi que plusieurs systèmes d'acquisition de sources de fer peuvent coexister chez une même espèce. Ainsi, les microbes produisent des substances de petit poids moléculaire appelées sidérophores qui chelatent l'ion ferrique avec une très grande affinité et qui peuvent aussi extraire le fer des protéines porteuses de fer comme la transferrine ou la lactoferrine. Les sidérophores chargés sont internalisés à travers la membrane externe après fixation sur récepteurs spécifiques. Les bactéries ont aussi des récepteurs de surface qui reconnaissent directement les protéines porteuses de fer comme la transferrine ou la lactoferrine, et aussi des récepteurs spécifiques de l'hème et des hémoprotéines comme l'hémoglobine ou l'hémopexine. Par ailleurs, les bactéries sécrètent de petites protéines appelées hémophores qui fixent l'hème libre ou lié à des hémoprotéines avec une très grande affinité puis le retournent à des récepteurs spécifiques. Chez les bactéries à Gram négatif, le transport à travers la membrane externe de ces sources de fer ou d'hème est dépendant de l'énergie dérivée de la force proton motrice et d'un complexe protéique de la membrane interne comprenant les protéines TonB, ExbB et ExbD. Le domaine périplasmique de TonB interagit avec une séquence conservée proche de l'extrémité N-terminale de ces divers récepteurs qui par ailleurs n'ont que peu de séquences primaires communes. Par contre, la cristallisation de certains de ces récepteurs fait apparaître une organisation tridimensionnelle commune: la partie C-terminale forme un tonneau de 22 brin b antiparallèles dont l'intérieur est partiellement occupé par la partie N-terminale localisée du côté périplasmique.

Les hémophores aussi appelés HasA forment une nouvelle famille d'hémoprotéines sans homologie avec d'autres protéines connues. Ces hémophores que nous avons d'abord identifiés chez Serratia marcescens sont également présents chez d'autres espèces bactériennes (Erwinia carotovora, Pseudomanas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens et Yersinia pestis). Leur rôle biologique est donc de capter l'hème de différentes hémoprotéines et de le délivrer à un récepteur spécifique HasR. Alors que le récepteur est indispensable à l'acquisition de l'hème, l'hémophore ne l'est pas, mais il optimise le système, réduisant la concentration minimale de substrat requise et élargissant le spectre des hémoprotéines substrats potentiels.
Nous avons caractérisé biochimiquement l'hémophore HasA de S. marcescens. C'est un monomère qui fixe une molécule d'hème avec une très grande affinité (10-11M). La structure tridimensionnelle de l'holoprotéine a été déterminée montrant un seul domaine composé de 4 hélices a et de 7 brins b organisés en feuillets anti-parallèles (voir figure ci-dessous). Le site de fixation de l'hème est très exposé au solvant et est formé par deux boucles flexibles avec une histidine (32) et une tyrosine (75) comme ligands axiaux du fer ferrique. Une deuxième histidine (83) pourrait aussi être impliquée dans la fixation de l'hème. La mutagénèse dirigée de ces 3 résidus en alanine nous a permis de construire les simples, doubles et triples mutants et de déterminer le rôle de chaque résidu dans la fixation de l'hème. La tyrosine 75 joue un rôle central et l'histidine 83 est un ligand de l'hème en l'absence des deux autres résidus. Nous avons également montré qu'aucun de ces résidus n'est impliqué dans l'interaction avec le récepteur.

Structure cristalline de HasA

HasA-3D-jaune.jpg


Les interactions entre l'hémophore et son récepteur ne se font pas par l'hème, mais impliquent une interaction proteine-proteine. L'apo et l'holo-hémophore se fixent avec des affinités semblables (5nM) sur le récepteur à un même site ou à des sites chevauchants. Ce site sur HasA est constitué de deux domaines de liaison, chacun situé sur un feuillet b de la protéine (en jaune sur la figure ci-dessus). Nous faisons l'hypothèse que la fixation de l'hémophore par ses deux sites de liaison déforme la protéine de telle façon qu'elle transfère son hème.

L'utilisation de l'hème lié à l'hémophore nécessite l'extraction de l'hème de la protéine porteuse. Ceci entraîne la rupture d'une liaison de haute affinité entre la protéine et son groupement prosthétique (Kd 10-11M) au profit d'une liaison de plus faible affinité entre l'hème et son récepteur (Kd estimé à 10-6M). Des comparaisons des profils spectrophotométriques des protéines purifiées HasA, HasR et du complexe HasA-HasR, chargées d'hème, suggèrent que le transfert d'hème d'une protéine à l'autre se produit in vitro sans apport d'énergie. La structure 3D du complexe hémophore-récepteur en cours de réalisation dans le laboratoire de W. Welte, à Constance en Allemagne, nous permettra de déterminer les résidus ligands du fer dans le complexe HasA-HasR. Après transfert de l'hème à HasR, l'apo-hémophore reste à la surface cellulaire. Comme l'apo- et l'holo-hemophore ont la même affinité pour le récepteur, on se demande comment se fait l'échange entre hémophores vides et chargés sur le récepteur. Nous venons de montrer que l'éjection de l'apo-hémophore nécessite de l'énergie et le transport concomittent de l'hème. Le recyclage des hémophores requiert une plus grande concentration en complexe TonB-ExbB-ExbD que l'acquisition directe d'hème (sans l'intervention d'hémophore). Le déchargement de l'hème des hémoprotéines est un processus qui intervient dans de nombreuses régulations chez les eucaryotes et dans le recyclage hépatique de l'hémopexine, transporteur sérique de l'hème. Les mécanismes de déchargement sont peu compris et nous espérons que HasA pourra servir de modèle dans ces études.

Alors que l'interaction entre hémophore et récepteur est indépendante de la protéine TonB, l'internalisation de l'hème est TonB-dépendante. S. marcescens possède un gène homologue à tonB localisé dans l'operon has appelé hasB. Les gènes hasB et tonB ont des fonctions redondantes uniquement pour l'acquisition de l'hème. TonB est indispensable à l'acquisition des autres sources de fer complexé à des sidérophores. HasB est donc une protéine TonB spécifique qui ne pourrait interagir qu'avec le récepteur HasR. Des homologues de TonB plus ou moins spécifiques ont également été identifiés chez Vibrio cholerae et chez P. aeruginosa.

Les gènes du système has de S. marcescens sont organisés en opéron: hasRADEB (voir figure ci-dessous). Il comprend les gènes codant pour le récepteur, l'hémophore, deux des trois protéines permettant la sécrétion de l'hémophore et HasB. Il est réprimé par Fur en présence de fer. En amont de cet opéron se trouvent deux gènes régulateurs hasI et hasS localisés dans une unité de transcription régulée par le fer et codant respectivement pour un facteur sigma (appartenant à la famille des sigmas ECF-extra cytoplasmic factor) et son anti-sigma. La fixation de l'hémophore chargé d'hème sur le récepteur HasR inactive l'anti-sigma et permet à HasI d'initier la transcription de l'opéron has. La fixation de l'hème seul sur HasR ne l'induit pas. Ceci montre que l'inducteur et le substrat transporté sont des molécules différentes. A l'aide d'une collection de mutants de HasA obtenus par insertion aléatoire de pentapeptides, nous cherchons quel est le stimulus moléculaire qui déclenche l'induction.
D'autre part, hasI est régulé par le répresseur Fur chargé en fer et n'est pas autorégulé. Nous venons de mettre en évidence une régulation entièrement nouvelle pour HasS, l'anti-sigma. Il est régulé par HasI et par conséquent soumis à la même cascade d'induction déclenchée par la fixation de l'holo-hémophore sur son récepteur. Ceci montre que le système Has est régulé positivement et négativement par la présence d'hème. Quand il y a assez d'hème, HasS s'accumule sous une forme inactive qui devient instantanément active dès que HasR n'est plus occupé par holo-HasA.


Le modèle de travail du système Has

Le systËme Has


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