GENERATION DE CELLULES SOUCHES HEMATOPOIETIQUES

Nous avons déterminé les phénotypes des différentes populations cellulaires dans la P-Sp/AGM et dans le SV et nous les avons identifiés par une analyse fonctionnelle : 1. les précurseurs hématopoïétiques émergents; 2. une population de macrophages primitifs de fonction inconnue; 3. le compartiment endothélial; 4. l’environnement stromal. Cette caractérisation va nous permettre d’étudier les signaux exprimés dans ces sites hémogéniques par une approche combinant RT-PCR en temps réel et hybridation in situ qui nous permettra de détecter l’expression de molécules responsables de différents aspects du développement. Nous nous concentrerons sur l’étude de Notch-1 et de ses ligands Delta et Jagged, et des protéines Wingless (Wnt). Ces deux familles de protéines ont été impliquées dans différents aspects de la maintenance des CSH. Une fois identifiées, les protéines qui sont exprimées de façon différentielle dans le SV et dans la P-Sp/AGM seront transfectées dans des lignées stromales et testées pour une induction hématopoïétique in vitro à partir de précurseurs mésodermiques isolés d’embryons de jour 7-8 de gestation. Les protéines capables d’induire la différenciation hématopoïétique sont utilisées pour construire des souris « knock-in » sous le contrôle de promoteurs qui induisent l’expression dans différents tissus mésodermiques. Ces souris seront ainsi capables d’une génération hématopoïétique ectopique. Ces études vont contribuer à la compréhension des signaux qui induisent la production de CSH et à la dissection des stimuli responsables de l’auto-renouvelement et/ou maintien des cellules souches.

Parmi les populations présentes dans la P-Sp/AGM, nous avons identifié une population de précurseurs hématopoïétiques, à jour 10.5 de gestation, qui exprime CD45 et comprend des macrophages. Ces cellules semblent correspondre aux macrophages primitifs d’origine toujours indéfinie chez les mammifères, mais préalablement identifiée chez le poisson zèbre comme provenant d’un troisième site hémogénique, la région cardiaque (Herbomel, P. Development 126:3735, 1999). Pour mieux déterminer l’origine et la fonction de ces cellules, nous avons établi une collaboration avec S. Jung (Rehovot, Israel) qui a généré une lignée de souris chez laquelle le gène codant pour la GFP est exprimé sous le contrôle du promoteur deCX3CR1. Ce récepteur de la chemokine fractalkine est exprimé par tous les macrophages et est impliqué dans leur migration vers les différents tissus (Geissmann et al., Immunity 19:71, 2003). Nous utiliserons les embryons de ces souris pour comprendre les capacités migratoires, l’origine et la fonction de ces macrophages primitifs, chez les mammifères, en collaboration avec la Plate-Forme d’Imagerie Dynamique à l’Institut Pasteur équipée avec de microscopes confocaux et d’un microscope biphotonique.

L’aorte dorsale embryonnaire est aussi le lieu d’origine des hémangioblastes et des mésangioblastes. Le premier type cellulaire est un précurseur commun aux cellules hématopoïétiques, endothéliales et murales. Le deuxième est un précurseur mésodermique capable, après culture à long terme, in vitro, de produire la majorité des tissus mésodermiques et qui peut restaurer la fonction musculaire de souris dystrophiques, après injection in vivo (Sampaolesi et al. Science 301:487, 2003). En collaboration avec M. Buckingham (Pasteur), nous utiliserons des souris “knock-in” chez lesquelles le gène de la GFP est exprimé sous le contrôle de promoteurs de transcription importants pour la détermination de cellules musculaires (Pax-3) ce qui permettra d’isoler des cellules précurseurs exprimant Pax-3 chez l’embryon et d’étudier leur devenir, ou de suivre l’apparition de cette expression dans des cellules en culture. Nous tenterons d’établir le lignage entre les CSH, les hémangioblastes et les mésangioblastes à partir de précurseurs mésodermiques indifférenciés.

Site créé par Marie-Christine Vougny (04/2004)