UNITÉ DES VIRUS ONCOGÈNES

Responsable
YANIV Moshe

e-mail : yaniv@pasteur.fr


CNRS URA 1644

Département des Biotechnologies
Institut Pasteur
25, Rue du Dr. Roux
75724 PARIS Cedex 15

Tél
01 4568 8512
Fax
01 4061 3033

Secrétariat

OLLIVIER Édith, IP

Chercheurs permanents

ARCANGIOLI Benoît, IP
MUCHARDT Christian, CNRS
PONTOGLIO Marco, CNRS
THIERRY Françoise, IP

Stagiaires de recherche

BAKIRI Latifa, Thèse
BOUALLAGA Isabelle, Thèse
CHERET Claire, Thèse
COFFINIER Catherine, Thèse
de LAHONDES Raynald, Thèse
GARCIA-CARRANCA Alejandro, Séjour sabbatique
GIRARDIN Stéphane, Thèse
LALLEMAND Dominique, Thèse
REYES-ROSA José Carlos, Postdoc
VAXILLAIRE Martine, Assistant de Recherche
VIOLLET Benoît, post-doc
WEITZMAN Jonathan, Postdoc
YEIVIN Agnès, Postdoc

Ingénieurs Techniciens Administratifs

BOURACHOT Brigitte, CNRS
DOYEN Antonia, IP
GARBAY Serge, CNRS
GOYAT Sylvain, CNRS

Le contrôle précis, dans le temps et dans l'espace, de la mise en route du programme génétique est essentiel pour le développement et le fonctionnement de l'organisme. Des perturbations de ce programme sont associées à des malformations congénitales, à des maladies ou à des transformations malignes. L'Unité des Virus Oncogènes aborde plusieurs aspects de ce contrôle. En étudiant la biologie des virus de papillomes, associés au cancer du col de l'utérus, chez la femme, ils ont montré que la protéine E2 codée par ces virus module la transcription de gènes viraux et est en même temps essentielle pour la réplication de l'ADN viral. Sa sur-expression dans des cellules tumorales, provenant d'un cancer du col, entraîne la mort de ces cellules par apoptose. Ils testeront la possibilité d'utiliser un adénovirus porteur de cette protéine comme outil thérapeutique afin de provoquer la mort des cellules tumorales. Des modifications de certains gènes appelés oncogènes, telles que des mutations dans les séquences codantes ou leur surexpression sont également associées aux transformations malignes. Deux familles d'oncogènes, jun et fos, sont étudiées dans l'Unité. Il a été montré que la surexpression de cJun provoque la mort de certaines cellules par apoptose et que le blocage de sa fonction protège les neurones de l'apoptose induite par l'absence de facteurs neurotropiques. Depuis de nombreuses années, l'Unité étudie deux facteurs de transcription à homéodomaine, HNF1 et vHNF1, qui s'expriment dans le foie, le rein, l'intestin et le pancréas. Les chercheurs de cette Unité ont montré que l'inactivation de HNF1, chez la souris, entraîne plusieurs syndromes : une phénylcétonurie, due à l'absence totale de la synthèse de la phénylalanine hydroxylase (PAH), un syndrome de Fanconi rénal (perte massive de glucose sérique) causé par l'absence d'un co-transporteur sodium-glucose (SGLT2) dans les tubules proximaux rénaux et un diabète non insulino-dépendant. Ces souris ont permis l'étude des mécanismes moléculaires responsables de diabètes de type II chez l'homme. La protéine Sap1 participe chez la levure S. pombe aux mécanismes mis en jeu pour établir une division asymétrique entre deux cellules filles est également étudié. La découverte d'une coupure simple brin dans un site de conversion génique permet de distinguer entre deux brins d'ADN et d'assurer une division asymétrique. Pour initier la transcription, des modifications de la structure chromatinienne (complexe DNA-histones) doivent avoir lieu, faisant intervenir divers facteurs protéiques. Ainsi il a été démontré qu'en l'absence de HNF1, le gène de la PAH reste totalement fermé, ce qui explique l'absence d'expression de cette enzyme chez les souris hnf1-/-. Deux complexes multiprotéiques jouant un rôle essentiel dans la régulation de la structure de la chromatine sont également étudiés dans l'Unité. Une sous-unité de l'un de ces complexes, Brahma (Brm) agit comme un régulateur négatif de la croissance cellulaire. Sa synthèse est inhibée par la transformation cellulaire par les oncogènes ras ou raf, et sa réintroduction dans les cellules en supprime le phénotype transformé. Cette suppression dépend de la capacité de la protéine Brm à interagir avec le produit du gène Rb, un gène suppresseur de tumeur chez l'homme. Ce travail constitue l'une des premières démonstrations de l'interférence de la transformation dans la régulation de l'expression des gènes, grâce à des changements de la structure de la chromatine.



Transcription et réplication des virus de papillome

(Isabelle Bouallaga)

Le papillomavirus HPV18 est un virus pathogène pour l'homme dont l'infection provoque la formation de lésions de la muqueuse du col utérin. Le virus se multiplie dans les kératinocytes de l'épithélium, la multiplication virale dépendant de leur différenciation terminale. Ces lésions, généralement bénignes, peuvent évoluer en carcinome épidermoïde. Les données épidémiologiques indiquent que ce type de cancer est très fréquent puisqu'il représente la deuxième cause de mortalité par cancer chez la femme, après le cancer du sein. L'un des événements clés de la conversion maligne des lésions associées aux papillomavirus est l'intégration de l'ADN viral dans le génome cellulaire. Il y a alors conservation d'une partie des séquences virales contenant notamment la totalité de la région de régulation et les deux gènes transformants E6 et E7, qui altèrent la prolifération cellulaire normale en neutralisant deux gènes suppresseurs de tumeurs cellulaires : p53 et pRB. La transcription des oncogènes viraux E6 et E7 est modulée par des facteurs de transcription cellulaires et viraux. Nous avons montré que les facteurscellulaires AP1 (Thierry et al., J. Virol, 1992, 66, 3740) et Sp1 (Demeret et al., J. Virol, 1994, 68, 7075) activent la transcription virale. En revanche, la protéine virale E2 réprime cette transcription (Thierry et Yaniv, EMBO J., 1987, 6, 3391). Le mécanisme de cette répression dépend du type cellulaire. Il met en jeu l'exclusion par fixation compétitive de E2 à l'ADN, des facteurs de transcription cellulaires TBP et Sp1 indispensables à l'activité du promoteur (Demeret, et al., J. Virol, 1997). La protéine E2 active aussi la réplicationde l'ADN viral de concert avec la protéine virale E1 (Demeret et al., Nucl. Acids Res., 1995, 23, 4777). L'interaction de E2 aux même sites dans la région de régulation à la fois réprime la transcription des oncogènes viraux et active la réplication de l'ADN viral. L'inactivation de deux protéines virales E2 et E1 semble jouer un rôle important dans le processus de tumorigénèse liée à HPV18, l'éliminationde leur activité par intégration du génome viral paraissant une phase essentielle du processus de conversion maligne. Nous avons montré que la réintroduction de E2 dans une lignée cellulaire issue d'un carcinome cervicale associé au virus HPV18 provoque un arrêt du cycle cellulaire et une mort cellulaire par apoptose (Desaintes et al., EMBO J., 1997, 16, 504). Ces effets sont dus, au moins en partie, à l'activation par E2 de la protéine P53. Nous tenterons de construire un virus hybride adéno-E2 qui pourra être utilisé pour provoquer l'apoptose de lésions tumorales.

Le rôle des gènes jun et fos dans le contrôle de la croissance cellulaire et de l'apoptose

(Latifa Bakiri)

Ces deux familles de gènes comprennent au total 7 membres (c-jun, junB,junD et c-fos, fosB, fra1 et fra2) chez la souris ou chez l'homme. Nous avons poursuivi l'analyse du rôle biologique de chacun de ces gènes. Nous avons montré que la tansition G0/G1 du cycle cellulaire s'accompagne de l'induction de cJun et JunB et d'une protéolyse initiale de JunD (Pfarr et al., Cell, 1994, 76, 747; Lallemand et al., Oncogene, 1997, 14, 819). Les fibroblastes murins, en croissance, contiennent surtout Fra2, cFos, FosB et Fra1 apparaissant seulement lors de la stimulation mitogénique. La transformation par l'oncogène ras modifie la synthèse des différents membres (augmentation de cJun et JunB, diminution de JunD, augmentation de Fra1 et blocage de l'induction de cFos et FosB) (Mechta et al., Oncogene, 1997, 14, 837). Nous avons montré que la surexpression de cJun et sa phosphorylation N-terminale sont suffisantes et essentielles pour l'entrée de certaines cellules en apoptose (fibroblastes : Bossy-Wetzel et al. EMBO J., 1997, 16, 1695 ; neurones : Ham et al., Neuron, 1995, 14, 927). Nous avons observé que la voie SAPK/JNK, responsable de la phosphorylation N-terminale de cJun, est fortement inhibée par le confluence cellulaire augmentant ainsi la résistance des cellules à l'apoptose induite par irradiation. Pour l'étude des propriétés biologiques des différents dimères Jun/Fos, des protéines de fusion monochaîne Jun-Fos ont été construites : ces protéines sont stables et capables de fixer des sites cibles et d'activer la transcription. La phosphorylation et la stabilité de JunB sont régulées au cours du cycle cellulaire. La protéine est phosphorylée par la kinase cdc2/cyclineB au cours du passage G2/M et est ensuite dégradée en grande partie. La surexpression de JunB ralentit le passage à travers la phase G1 du cycle cellulaire. Une des cibles de son action négative semble être le gène de la cycline D1. Il est activé par c-jun ou junD (faiblement) mais inhibé par junB. En collaboration avec Dominique Thépot et Jacqueline Barra, nous avons obtenu des souris mutantes junD-/-. Les homozygotes sont viables, contrairement aux souris c-jun-/- et junB-/-. L'étude détaillée de l'expression de la beta-galactosidase dans ces souris (insérée à la place de junD) révèle un certain nombre de domaines distincts, entre autres, le cervelet et les testicules. Ce dernier site d'expression explique probablement la stérilité mâle partielle que nous observons chez ces souris. L'étude de fibroblastes préparés à partir d'embryons junD-/- montre que ce gène est essentiel pour la croissance de cellules en culture. Cette inhibition est perdue dans des cellules double mutants junD-/- p53-/- et révèle une interaction entre ces deux gènes. Cette interaction est également observée au niveau de l'animal. Les souris double mutants souffrent d'un défaut de motricité.

La machinerie SNF/SWI et son rôle dans le contrôle de la croissance cellulaire

(Brigitte Bourachot)

Les protéines SNF/SWI de levure S. cerevisiae s'associent dans un complexe multiprotéique impliqué dans l'activation transcriptionnelle de nombreux gènes et cela par un mécanisme lié à la décondensation de la chromatin. En identifiant des homologues humains ou murins des protéines SNF2/SWI2 et SNF5, nous avons démontré qu'un complexe similaire était également présent dans les cellules de mammifère et que ce complexe était impliqué dans le mécanisme d'activation de la transcription par plusieurs récepteurs nucléaires (Muchardt and Yaniv, EMBO Journal, 1993, 12, 4279 ; Muchardt et al., Nuc. Acid. Res., 1995, 23, 1127). Des travaux récents de purification du complexe SNF/SWI de levure ont suggéré que ce complexe était associé à l'holoenzyme de la RNA polymerase II (ARN pol II) (Wilson et al., Cell, 1996, 84, 235). En réalisant un co-marquage immunocytochimique de l'ARN pol II et de hbrm (homologue humain de SNF2/SWI2), nous avons observé que dans des cellules humaines, ces deux protéines n'étaient pas systématiquement co-localisées. Cependant, hbrm était essentiellement présent dans des régions à faible densité d'ADN, probablement transcriptionnellement actives. Par des expériences de fractionnement de la chromatine, nous avons également observé que la chromatine active soluble et insoluble est enrichie en complexe SNF/SWI humain (hSNF/SWI) par rapport à la chromatine totale. hSNF/SWI est également associé à la matrice nucléaire, suggérant que ce complexe pourrait jouer un rôle dans l'organisation structurelle de la chromatine (Reyes et al., J. Cell. Biol., 1997, 137, 263). L'observation des cellules au cours du cycle cellulaire a par ailleurs montré que la protéine hbrm est phosphorylée au début de la phase mitotique. Cette phosphorylation a pour effet de dissocier la protéine de ces cibles nucléaires. Ainsi, pendant cette phase du cycle, la protéine hbrm est exclue des chromosomes condensés. Il est probable que l'inactivation de hbrm par phosphorylation en début de phase mitotique constitue l'un des mécanismes permettant d'obtenir un arrêt transcriptionnel pendant cette phase du cycle cellulaire (Muchardt et al., EMBO Journal, 1996, 15, 3394). Nous avons aussi observé que la protéine hbrm est souvent absente dans des lignées de cellules transformées et que la réintroduction de cette protéine dans des cellules transformées par Ras conduit à la réversion du phénotype transformé, probablement par un mécanisme impliquant une coopération avec l'anti-oncogène p105Rb (Muchardt et al., EMBO J., 1998, 17, 223). Cette hypothèse a été confirmée par l'observation de Brm coopérant avec Rb dans la répression du facteur E2F (étude effectuée en collaboration avec le groupe de T. Kouzarides, Trouche et al., Proc. Natl Acad. sci., 1997, 94, 11268). Le rôle du complexe snf/swi in vivo a été étudié grâce à l'inactivation du gène mbrm (homologue souris de SNF2/SWI2) par recombinaison homologue chez la souris, en collaboration avec le laboratoire de Charles Babinet. Ces souris sont viables mais plus grandes que leurs frères et soeurs normaux. Les fibroblastes dérivés de ces souris montrent un défaut dans leur capacité de devenir quiescents en confluence, en accord avec les observations citées précédemment. Les souris brm-/- accumulent des concentrations accrues de Brg1, son proche homologue. Nous croisons actuellement nos souris avec des hétérozygotes brg1-/- (ceci, en collaboration avec T. Magnusson à Cleveland) pour tester si, au moins, l'un des deux gènes est essentiel pour le développement normal.

HNF1 (Hepatic Nuclear Factor 1), un régulateur des fonctions hépatique, rénale, intestinale et pancréatique

(Claire Chéret)

HNF1 a été initialement caractérisé comme une homéoprotéine qui régule l'expression d'un grand nombre de gènes hépatiques (albumine, fibrinogènes alpha et beta, antitrypsine alpha, protéine réactive C etc). Des études ultérieures ont révélé qu'elle s'exprime, comme son proche homologue vHNF1, dans plusieurs types de cellules épithéliales engagées dans un trafic important de protéines (épithélium intestinal, tubes proximaux des reins, pancréas). Dans nos études, nous avons voulu établir leur rôle possible dans l'organogenèse et au cours de la vie postnatale. L'inactivation de HNF1 chez la souris a montré qu'il n'est pas essentiel au développement, mais plutôt pour la survie postnatale (Pontoglio et al., Cell, 1996, 84, 575). Les souris hnf1-/- souffrent d'un dysfonctionnement hépatique et rénal qui entraîne une phénylcétonurie, d'un syndrome de Fanconi rénal (gluconurie, amino-acidurie, phosphonurie et d'un diabète de type II). Ce dernier est probablement dû à une forte diminution de l'activité d'un co-transporteur sodium/glucose rénal. Nous avons montré que contrairement à la majorité des gènes cibles hépatiques qui sont transcrits à un taux réduit, l'ARNm codant pour la phénylalanine hydroxylase (PAH) est totalement absent. Des études effectuées en collaboration avec le laboratoire de Mary Weiss ont montré que les changements dans la structure chromatinienne de ce gène, associés à son activation transcriptionnelle, ne sont pas détectables chez les souris mutantes. De même, ce gène demeure méthylé chez ces souris. Par contre, le gène albumine est sensible à la DNaseI et devient déméthylé chez les mutants. Nous avons montré que l'un des sites est hypersensible à la DNase I et à la nucléase micrococcale (-1,2 kb) et contient deux séquences de fixation pour HNF1. Cet élément dépourvu d'une activité de type activateur classique, pourrait être responsable de la déméthylation et du réarrangement de la chromatine au cours du développement. L'absence de HNF1 entraînerait une extinction totale du gène. Par contre, pour les autres gènes cibles, HNF1 est un facteur de transcription proximal parmi d'autres. Son absence entraîne uniquement une baisse de transcription mais pas une extinction. Ces travaux illustrent que l'inactivation d'un facteur de transcription n'entraînerait l'extinction totale que d'un nombre restreint de gènes pour lesquels ce facteur joue un rôle clé dans le remodelage de la chromatine et dans la déméthylation de l'ADN au cours du développement (Pontoglio et al., Mol. Cell. Biol., 1997, 17, 4948). Quant au syndrôme de Fanconi rénal, nous avons montré qu'il est du à l'absence ou la diminution de transcription de gènes codant pour un co-transporteur sodium/glucose (SGLT2) et d'un co-transporteur de phosphate NaPi1 (Pontoglio et al., en préparation). Des études récentes, effectuées dans les laboratoires de Graeme Bell et Philippe Froguel, ont révélé que des mutations dans le gène HNF1 sont associées à un diabète non-insulino-dépendant du jeune âge (Yagamata et al., Nature, 1996, 384, 455). Contrairement à l'homme qui développe une maladie autosomale dominante, nos souris hétérozygotes sont saines. Pour essayer de comprendre cette différence, nous tentons actuellement, en collaboration avec Ph. Froguel à Lille, de déterminer si les mutations constatées chez l'homme sont de nature dominante négative, contrairement à une mutation nulle chez nos souris. En collaboration avec l'équipe de K. Polonsky à Chicago, nous avons montré que les souris hnf1-/- synthétisent l'insuline mais ne la secrètent pas en présence de glucose. Ces cellules beta-pancréatiques montrent un défaut de signalisation du à un déficit de synthèse de l'ATP, en présence d'une haute concentration de glucose (Pontoglio et al., soumis pour publication). L'inactivation stable et conditionnelle (cre/lox) de vHNF1 est en cours. L'étude de ces souris et leur croisement avec les souris hnf1+/- permettront d'établir le rôle du binôme hnf1-vHNF1 dans le développement et la survie de la souris.

Sap1, un régulateur des changements de type sexuel et de la mitose chez S. pombe

(Benoît Arcangioli)

Le cycle biologique de la levure Schizosaccharomyces pombe nécessite à la fois l'expression d'un programme de division cellulaire asymétrique, permettant l'alternance des types sexuels, et une réponse adéquate à des stress physiologiques, aboutissant à la formation de quatre spores. Un phénomène d'empreinte chromosomique au locus sexuel est responsable des divisions asymétriques chez cette levure. Deux gènes ont été identifiés comme impliqués dans le processus de division asymétrique, le gène swi7 codant pour la sous-unité catalytique de l'ADN polymérase a, et le gène sap1 qui fait l'objet de notre étude (Arcangioli et Klar, EMBO J., 1991, 10, 2025). Le gène sap1 code pour une protéine dimèrique qui interagit avec une séquence d'ADN spécifique comprenant deux motifs TAACG, répétés dans la même orientation et distants de 5 pb (Arcangioli et al., Nucl. Acids Res., 1994, 22, 2930). Les domaines protéiques impliqués dans la reconnaissance de l'ADN et dans la dimérisation ont été identifiés. L'ensemble des données dont nous disposons indiquent que sap1 code pour un nouveau prototype de protéine formant avec l'ADN, un complexe intrinsèquement asymétrique (Ghazvini et al., Mol. Cell. Biol., 1995, 15, 4939). En collaboration avec Marc Delarue (à l'Institut Pasteur), nous poursuivons l'analyse structurale de Sap1 et avons entrepris l'étude cristallographique du complexe ADN/protéine. L'étude fonctionnelle montre que ce gène est essentiel à la croissance indépendamment de sa fonction au locus sexuel. Par la suite, nous avons isolé un mutant conditionnel de sap1, qui est bloqué entre les phases G2 et M du cycle cellulaire, sans mort cellulaire. D'autre part, nous avons montré que l'expression de sap1 est sous le contrôle d'un dosage génique très strict. Une augmentation de la concentration intracellulaire de cette protéine affecte la viabilité des cellules. Le développement et l'utilisation de la vidéo-microscopie assistée par ordinateur a permis l'observation de mitoses en temps réel et de visualiser des cassures chromosomiques et des aneuploïdies lors de la surproduction de Sap1. Ces phénotypes sont associés à un bouleversement important de la structure nucléaire. Nous avons également isolé un gène candidat "homologue" à sap1 dans une autre levure. Il est tentant de suggérer que sap1 pourrait faire partie de la famille des gènes dont la fonction a été conservée au cours de l'évolution exerçant une fonction importante dans la dynamique de la chromatine au cours du cycle cellulaire.



The correct control, in time and space, of the onset of the genetic program is essential for the development and survival of an organism. Perturbations of this program are associated with congenital malformation, with disease or with malignment transformation. The Oncogenic Viruses Unit deals with several aspects of this control. Studying the biology of papillomaviruses, some of which are associated with cervical carcinoma, they have shown that the viral E2 protein that modulates the transcription of viral genes, is also essential for the initiation of viral DNA replication. Its overexpression in cells derived from virally-associated cervical carcinoma lesions induces their death by apoptosis. The laboratory is trying to use adenoviral vectors encoding E2 in an attempt to kill such tumor cells. Mutations in the coding sequences or overexpression of certain genes, defined as oncogenes, are associated with malignant transformations. Two families of such genes, jun and fos, are currently studied. It was shown that c-jun overexpression also drives cells into apoptosis. Blocking its function protects neurons against apoptosis induced upon withdrawal of survival signals. For a number of years, they have been studying the two homeoproteins, HNF1 and vHNF1, which are expressed in liver, kidney, intestine and pancreas. The inactivation of HNF1 in mice generates a murine model for three human syndromes : phenylketonuria, caused by the total absence of phenylalanine hydroxylase (PAH), a renal Fanconi syndrome (massive urinary loss of glucose) caused by the failure to synthesize the SGLT2 sodium-glucose co-transporter in the proximal tubules of the kidney and a non insulin-dependent diabetes. These mice have made possible to study the molecular mechanisms involved in b-cell dysfunction in type II diabetes. The mechanisms involved in asymetric cell division are studied in S. pombe. The discovery of a single stranded nick at the site of gene conversion (mating type switch locus) should permit distinction between the two daughter strands and enable such an asymetric division. The chromatin (DNA-histone complex) has to be modified to permit transcription initiation and elongation. It was shown, for example, that in the absence of HNF1, the gene encoding PAH remains in a closed conformation, explaining its silencing in hnf1-/- mice. Two multi-proteins complexes of the snf/swi family that are involved in chromatin remodelling are studied. One of the subunits of such a complex, the brm putative helicase, behaves as a negative regulator of growth. Its synthesis is inhibited in cells transformed by Ras or Raf and its re-expression in such cells reverses their transformed phenotype. Reversion is dependent on a domain in Brm that binds to the product of the Rb tumor suppressor gene. These results constitute one of the first demonstrations of the effect of oncogenes on gene regulation via chromatin structure changes.