UNITÉ DE RECOMBINAISON ET EXPRESSION GÉNÉTIQUE

Responsable
TIOLLAIS Pierre

e-mail : tiollais@pasteur.fr


INSERM U163

Département du Sida et des Rétrovirus
Institut Pasteur
25/28 Rue du Dr. Roux
75724 PARIS Cedex 15

Tél
01 4568 8820
Fax
01 4568 8943

Secrétariat

DA Louise-Marie, IP

Chercheurs permanents

BUENDIA Marie-Annick, CNRS
DEJEAN Anne, INSERM
TRANSY Catherine, INSERM
WEI Yu, IP

Stagiaires de recherche

COUILLIN Isabelle, Post-doc
DAVID Grégory, Thèse
FLAJOLET Marc, Thèse
LEHEMBRE François, Thèse
LEVY Rafaël, Thèse
LOIRAT Delphine, Thèse
MÜLLER Stefan, Post-doc
NAGAI Hisaki, Post-doc
PINEAU Pascal, Thèse
POLLICINO Térésa, Post-doc
SEELER Jacob, Post-doc
SITTERLIN Delphine, Thèse
TERRADILLOS Olivier, Thèse

Ingénieurs Techniciens Administratifs

BERGAMETTI Françoise, P7
FAURE Caroline, Etudiante Stagiaire
MANCINI Maryline, IP
MARCHIO Agnès, IP
MICHEL Marie-Louise, INSERM
PRIGENT Sylvie, INSERM
RENARD Claire-Angélique, IP

L'Unité de Recombinaison et Expression Génétique effectue des recherches sur l'oncogénèse, la virologie moléculaire et le vaccin recombinant contre l'hépatite B. Le virus de l'hépatite B (HBV) peut engendrer un cancer du foie et il est par conséquent très important d'élucider les mécanismes par lesquels ce virus provoque ce cancer. Sur un modèle animal, la marmotte, nous avons montré que le virus de l'hépatite de la marmotte induit le cancer du foie en s'insérant à proximité d'un gène myc. Nous précisons également le rôle potentiel de la protéine virale régulatrice HBx dans le processus de cancérisation. Notamment, nous étudions les perturbations engendrées par les interactions entre la protéine virale et des protéines de la cellule hôte. Nous étudions d'autre part l'importance de l'apoptose dans le développement de l'hépatocarcinome. Nous portons aussi nos efforts pour comprendre le mécanisme de l'oncogénèse moléculaire hépatique chez l'homme. Nous cherchons à identifier des gènes suppresseurs de tumeur impliqués dans ce type de cancer. Notre laboratoire étudie également le rôle des protéines PML, RARa et PML-RARa dans la leucémie aiguë à promyélocytes. Nous avons également initié des travaux sur le virus de l'hépatite C dont on connait mal le mécanisme de réplication, en vue de préciser les partenaires viraux et cellulaires de la polymérase virale. Concernant le vaccin recombinant contre l'hépatite B, nous cherchons à mettre au point un modèle de vaccin génétique. Ce type de vaccin induit des réponses humorale et cellulaire. Nous allons tester ce vaccin chez les primates. Nous participons par ailleurs à un protocole de vaccinothérapie des porteurs chroniques de l'HBV (en collaboration avec C. Bréchot). Ce protocole repose sur des résultats que nous avons obtenus chez des souris transgéniques exprimant l'antigène de surface. Enfin nous utilisons cet antigène comme système de présentation d'épitopes.



Protéine régulatrice HBx du virus de l'hépatite B (HBV)

(Catherine TRANSY)

Le rôle précis de la protéine régulatrice HBx codée par le virus HBV dans l'établissement de l'infection virale et dans la carcinogénèse hépatique reste à identifier. La caractérisation de partenaires cellulaires potentiels de la protéine HBX nous a permis de montrer que la protéine UVDDB est une cible physiologique de la protéine virale, impliquée dans son activité de transactivation de la transcription. La protéine UVDDB qui reconnait spécifiquement l'ADN endommagé par les rayons UV pourrait intervenir dans les phénomènes de réparation de l'ADN. Nous poursuivons actuellement l'étude fonctionnelle de l'interaction HBx-UVDDB. Notamment, nous examinons le rôle possible de cette interaction dans l'établissement de l'infection virale, en utilisant le modèle WHV (virus de l'hépatite de marmotte). Nous avons ainsi fabriqué une collection de mutants de la protéine X de WHV (virus de l'hépatite de marmotte), diversement affectés dans leur liaison avec UVDDB et caractérisons le phénotype (en particulier l'infectiosité) des virus mutants correspondants. Par ailleurs, nous avons fabriqué des lignées cellulaires exprimant de manière stable, soit une forme sauvage active, soit une forme mutante non transactivatrice (et ne liant pas UVDDB) de la protéine HBx. La caractérisation de ces lignées met en évidence des modifications physiologiques de la cellule hôte, occasionnées spécifiquement par la forme active de la protéine HBx, notamment dans la réponse à des agents inducteurs d'apoptose sans que les mécanismes de réparation de l'ADN soient affectés.

Interactions physiques entre les protéines codées par le virus de l'hépatite C (HCV) et entre l'ARN viral et les protéines de l'hôte

(Catherine TRANSY)

Les différentes protéines du virus HCV sont produites par protéolyse d'un précurseur unique codé par le génome viral ARN. La nature exacte des produits maturés ainsi que leur assemblage possible en sous-complexes de fonction déterminée sont largement méconnus. En collaboration avec le laboratoire du métabolisme des ARN (Institut Pasteur), nous avons tenté d'établir la carte des interactions protéiques susceptibles d'être engagées par les différents polypeptides viraux. Les interactions ont été examinées par la méthode double-hybride, grâce à l'utilisation de banques de polypeptides aléatoires couvrant la totalité de la polyprotéine. Cette approche a révélé diverses interactions dont certaines non décrites jusqu'ici et qui feront l'objet d'une caractérisation plus approfondie. Par ailleurs, la présence de structures secondaires dans les parties 5' et 3' non traduites de l'ARN viral évoque la possibilité d'interactions spécifiques ARN viral-protéines de l'hôte. Ces protéines sont actuellement recherchées par criblage triple-hybride de banques d'ADNc hépatocytaires.

Oncogénèse hépatique et apoptose

(Marie Annick BUENDIA)

L'importance de la mort cellulaire programmée ou apoptose au cours du développement de l'hépatocarcinome est évaluée dans des modèles de souris transgéniques portant un gène c-myc activé dans le foie. Le rôle des gène Fas et p53 est étudié en croisant les transgéniques c-myc avec des souris invalidées soit pour Fas (souris lpr et Fas -/-), soit pour p53. La recherche de pertes d'allèles fréquentes dans les hépatocarcinomes de souris est effectuée en utilisant des marqueurs microsatellites afin de localiser et d'identifier des gènes suppresseurs de tumeurs inactivés au cours du processus tumoral. La contribution du gène X du virus de l'hépatite B dans la dérégulation du contrôle du cycle cellulaire l'apoptose et l'oncogénèse hépatique est étudiée in vivo dans des souris bitransgéniques et ex vivo dans des cellules hépatiques en culture. L'activation de la voie de signalisation Wnt au cours de l'hépatocarcinogénèse est étudiée chez l'homme et dans des modèles transgéniques murins : recherche de formes mutées de la beta-caténine, de la E-cadherine et du gène suppresseur de tumeurs APC, et recherche des gènes bibles de la beta-caténine activée.

Virus de l'hépatite de la marmotte et hépatocarcinome

(Marie Annick BUENDIA)

La marmotte infectée par le virus de l'hépatite de la marmotte (WHV) constitue un modèle pour l'étude des mécanismes du développement de l'hépatocarcinome associé au virus de l'hépatite B chez l'homme. L'intégration du virus WHV dans le génome cellulaire provoque l'activation d'un oncogène de la famille myc(c-myc ou N-myc2) par mutagenèse insertionnelle dans plus de 90% des hépatocarcinomes de marmotte. L'importance de l'activation des gènes myc dans le processus tumoral est démontrée dans des modèles transgéniques. Les mécanismes de l'hépatocarcinogénèse sont également étudiés chez l'écureuil infecté par un hépadnavirus proche du virus de la marmotte.

Recherche de gènes suppresseurs de tumeur impliqués dans le développement du cancer du foie

(Anne DEJEAN)

Dans le but d'identifier de nouveaux gènes suppresseurs de tumeur inactivés au cours du développement du cancer du foie, une cartographie des pertes d'allèles les plus fréquentes a été réalisée sur l'ensemble des chromosomes humains dans plus de 120 hépatocarcinomes. Plusieurs régions chromosomiques montrant de fréquentes pertes d'hétérozygotie ont été définies par la méthode des marqueurs microsatellites. La recherche de séquences uniques, transcrites et conservées dans l'évolution, est effectuée de façon systématique dans des clones de chromosomes artificiels YAC et BAC couvrant les domaines sélectionnés.

Bases moléculaires de la leucémie aiguë promyélocytaire

(Anne DEJEAN)

Notre équipe étudie depuis plusieurs années le rôle des récepteurs aux rétinoïdes dans l'oncogénèse chez l'homme. Nous avons pu montrer que la translocation t(15,17) associée aux leucémies aiguës promyélocytaires (LAP) génère une protéine hybride entre la protéine PML et le récepteur alpha de l'acide rétinoïque (PML-RAR-alpha). La protéine PML est localisée au niveau de structures subnucléaires appelées corps nucléaires qui sont désorganisés de manière réversible par l'acide rétinoïque (AR) dans les cellules LAP. Cette observation, qui permet d'impliquer une structure nucléaire dans une pathologie humaine, corrèle de façon frappante avec l'effet thérapeutique de l'AR dans ce type d'hémopathie. Nos travaux viseront d'une part à tenter d'élucider le rôle des corps nucléaires PML et d'autre part à clarifier le mécanisme d'action de l'hybride PML-RAR-alpha dans la genèse des LAP.

Antigène HBs et vaccination

(Marie-Louise MICHEL)

Pour aborder certains problèmes non résolus actuellement par la vaccination contre l'hépatite B, nous avons développé un modèle de vaccin génétique anti-hépatite B, basé sur l'injection intramusculaire de vecteurs plasmidiques codant pour les trois protéines d'enveloppe du virus. Ce nouveau type de vaccin permet d'obtenir, chez la souris, des réponses humorales et cellulaires multispécifiques, très stables. Chez des macaques Rhésus, des lymphocytes T cytotoxiques spécifiques de l'HBV et des anticorps anti-HBs ont été induits par injection de ces plasmides. Nous avons montré que ce type de vaccin pourrait également être utilisé pour rappeler une immunité ancienne due à des vaccins protéiques classiques. Les porteurs chroniques de l'HBV présentent un risque accru de développer un hépatocarcinome et représentent, par ailleurs, un réservoir important pour la dissémination du virus. Nous avons utilisé des souris transgéniques pour l'antigène de surface du virus (AgHBs) comme modèle d'étude et montré qu'il est possible chez ces souris d'induire par la vaccination génétique une réponse immunitaire suffisamment forte et efficace pour éliminer l'AgHBs sérique et contrôler l'expression des gènes viraux dans le foie. Nous participons également à un protocole multicentrique de vaccinothérapie des porteurs chroniques conduit par Christian Bréchot (Hôpital Necker). Chez ces patients, qui sont immunisés avec des vaccins recombinants classiques, nous cherchons à caractériser une réponse cellulaire induite par la vaccination et qui pourrait être responsable de l'élimination de l'ADN viral sérique observée chez certains patients après vaccination. L'AgHBs étant un immunogène particulièrement efficace, nous l'avons utilisé comme système de présentation d'épitopes B et T hétérologues. En collaboration avec Y. Rivière (I.P.) nous avons utilisé des vecteurs ADN codant pour des antigènes hybrides HIV1-HBs pour induire chez des Rhésus macaques une immunité humorale et cellulaire spécifique des virus HIV et HBV.



The "Unité de Recombinaison et Expression Génétique" conducts research on oncogenesis, molecular virology and hepatitis B recombinant vaccine. The hepatitis B virus (HBV) can induce liver cancer and it is therefore very important to understand the mechanisms underlying this viral oncogenesis. In an animal model, the woodchuck, we have shown that the woodchuck hepatitis virus induces liver cancer after integration near a myc gene. We are also investigating the potential roles of the regulatory HBx viral protein in the oncogenic process and the interactions of this protein with host cellular proteins. Moreover, we study the importance of apoptosis in the development of hepatocarcinoma. In an effort to understand the molecular basis of liver oncogenesis in humans : we are looking to identify tumor suppressor genes involved in this cancer. Our laboratory is also studying the role of the PML, RARa and PML-RARa oncogenic proteins in promyelocytic acute leukemia. We have also initiated research on hepatitis C virus. The replication mechanism of this virus is poorly understood and we are therefore attempting to elucidate the viral and cellular partners of the viral polymerase. Concerning the recombinant vaccine against hepatitis B we are now developing a model genetic vaccine. This vaccine induces humoral and cellular immune response. This vaccine will be tested in primates. We participated also in vaccinotherapy trials on HBV chronic carriers (in collaboration with C. Bréchot). This protocol for these trials is based on results we have obtained in transgenic mice expressing the surface antigen. Finally we are also using this antigen as a system for the presentation of heterologous epitopes.