UNITÉ DE RÉGULATION ENZYMATIQUE DES ACTIVITÉS CELLULAIRES

Responsable
VERON Michel

e-mail : mveron@pasteur.fr


CNRS URA 1773

Département de Biologie Moléculaire
Institut Pasteur
25/28 Rue du Dr. Roux
75724 PARIS Cedex 15

Tél
01 4568 8403
Fax
01 4568 8399

Secrétariat

DEMOND Anne

Chercheurs permanents

DEVILLE-BONNE Dominique, MC
VERON Michel, CNRS

Stagiaires de recherche

AGOU Fabrice, Post-doc
BIONDI Ricardo, Post-doc
DAMMANN Heike, Post-doc
MESNILDREY Sébastien, Thèse
SCHNEIDER Benoît, DEA
SELLAM Olivier, Thèse
STOCK Jeffry, Professeur Priceton University

Ingénieurs Techniciens Administratifs

CORTES Marie-Thérèse
TRAINCARD François

L'unité de Régulation Enzymatique des Activités Cellulaires utilise Dictyostelium discoideum comme système modèle de développement. La protéine kinase dépendante de l'AMPc (PKA), impliquée dans la transduction des signaux, est indispensable à l'agrégation des cellules qui constitue la première étape de la différenciation, ainsi qu'à la maturation des spores. Chez Dictyostelium, l'altération des niveaux intracellulaires de l'activité PKA produit des phénotypes bien définis. Nous avons étudié les propriétés biochimiques et fonctionnelles de la sous-unité catalytique de la PKA par une combinaison de méthodes biochimiques utilisant la protéine purifiée et de méthodes génétiques, par transfection dans une souche dépourvue de PK endogène. D'autre part, nous avons poursuivi l'étude de la Nucléoside Diphsophate Kinase (NDP kinase) au niveau biochimique et structural. Cette enzyme qui catalyse la synthèse des nucléotides triphosphates à partir des diphosphates, est impliquée dans la phosphorylation des analogues de nucléotides utilisés comme antiviraux, et notamment de l'AZT. La NDP kinase est aussi capable d'interagir avec les acides nucléiques et d'activer la transcription de certains gènes in vivo. Nous avons montré pour la première fois que l'état actif de la protéine correspond à l'association des sous-unités en hexamères alors que la fixation avec des oligonucléotides est considérablement accrue quand les sous-unités de 17 kDa sont associées en dimères.



Étude biochimique de la Protéine kinase dépendante de l'AMPc (PKA) de Dictyostelium discoideum.

(François Traincard)

La PKA de Dictyostelium est composée de sous-unités régulatrices et catalytiques associées en un holoenzyme inactif. La sous-unité catalytique sauvage ainsi que des protéines mutantes obtenues par mutagenèse dirigée ont été purifiées à partir de bactéries recombinantes. Leurs propriétés biochimiques montrent qu'un domaine de 30 kDa, situé à l'extrémité N-terminale de la chaine polypeptidique, n'est pas nécessaire à l'activité catalytique. Par contre, le remplacement en Ala d'un des deux résidus Phe constituant l'extrémité C-terminale entraine une perte totale d'activité.

Étude fonctionnelle in vivo de la Protéine kinase dépendante de l'AMPc (PKA) de Dictyostelium discoideum.

(Heike Dammann)

L'inactivation du gène codant pour la sous-unité C de la PKA bloque totalement le processus de différenciation. La transfection de cette souche PKA-nulle avec le gène sauvage rétablit la capacité des cellules à agréger. Des plasmides codant pour des protéines délétées dans différents domaines ont été transfectés dans la souche PKA-nulle. La caractérisation des phénotypes des transformants a permis de définir différents domaines fonctionnels de la PKA et de montrer qu'une complémentation en trans- entre le domaine catalytique et le domaine N-terminal, tous deux inactifs à l'état isolés, rétablissait la fonctionnalité de la protéine.

Relation entre structure oligomérique et activité chez la Nucleoside Diphosphate kinase (NDP kinase)

(Sébastien Mesnildrey)

La NDP kinase catalyse l'échange de phosphate entre des nucléosides tri- et diphosphates. Depuis pluisieurs années, nous étudions les propriétés de cette protéine qui, en plus de sa fonction dans le métabolisme intermédiare des nucléotides, a été impliquée dans la différenciation chez la Drosophile et dans la métastase des cellules cancéreuses chez l'Homme. En utilisant des mutants de la NDP kinase Dictyostelium, nous avons montré que l'association des sous-unités (17kDa) en hexamères était nécessaire à l'activité catalytique. L'équilibre oligomérique dimère/hexamère est fortement influencé par la fixation de nucléotides au site actif.

NDP kinase et phosphorylation des analogues de nucléotide à pouvoir antiviral (AZT, ddI).

(Dominique Deville-Bonne)

La NDP kinase joue un rôle important dans le métabolisme des nucléosides et en particulier dans les analogues de nucléosides utilisés dans les thérapies anti-virales comme l'AZT. Nous avons étudié les cinétiques de phosphorylation de l'AZT-diphosphate (AZT-DP) et de plusieurs didéoxynucléotide diphosphates, et montré que, contrairement à l'opinion couramment admise, ces analogues utilisés dans les multi-thérapies constituent de mauvais substrats pour la NDP kinase. La structure du complexe entre l'AZT-DP et la NDP kinase, déterminée à haute résolution, fournit une explication des propiétés biochimiques au niveau atomique (en collaboration avec l'équipe de Joël Janin, à Gif-sur-Yvette).

Interaction entre la NDP kinase et les acides nucléiques

(Fabrice Agou)

La NDP kinase possède également la propiété de se fixer à des oligonucléotides et de joue le rôle d'activateur de la transcription de plusieurs gènes dont c-myc. Un complexe de haute affinité (5 nM) a pu être mis en évidence, et différentes méthodes ont été utilisées pour montrer que l'interaction entre NDP kinase et des oligonucléotides synthétiques intervient spécifiquement avec une forme dimérique de l'enzyme.



The « Unité de Régulation Enzymatique des Activités Cellulaires » uses Dictyostelium discoideum as a model system to study development. The cAMP dependent protein kinase (PKA) is involved in the aggregation of cells which constitute the first step in the differentiation process , and in spore maturation. In Dictyostelium , modulation of intracellular PKA levels results in well characterized phenotypes. We have studied the biochemical and functional properties of the catalytic subunit of PKA with a combination of biochemical methods using the purified protein and genetical methods by transfecting in a PKA-null strain. We have also further studied Nucléoside Diphosphate Kinase (NDP kinase), both at the biochemical and the structural levels. This enzyme which catalyzes the synthesis of nucleotides triphosphates from nucleotides diphosphates is also involved in the phosphorylation of nucleotides analogues used as anti-viral drugs, including AZT and ddI. NDP kinase also interacts with nucleic acids and activates transcription of a number of genes in vivo. We have shown for the first time, that catalytically active protein is the hexamer while binding to DNA oligonucleotide is highly increased when the 17kDa subunits are associated into dimeric particules