UNITÉ DE PHYSIOPATHOLOGIE DE L'INFECTION

Responsable
MARCHAL Gilles

e-mail : gmarchal@pasteur.fr


Institut Pasteur

Département de Physiopathologie
Institut Pasteur
25/28 Rue du Dr. Roux
75724 PARIS Cedex 15

Tél
01 4061 3304
Fax
01 4061 3332

Secrétariat

COURMARCEL Fabienne, IP

Chercheurs permanents

GARAPIN Axel-Claude, IP

Stagiaires de recherche

HORN Cynthia, Thèse
LAQUEYRERIE Anne, Thèse
ROTTMAN Martin, DEA

Ingénieurs Techniciens Administratifs

CHAVAROT Pierre, IP
MA Laurence, IP
MARANGHI Eddie,IP
PESCHER Pascale, IP
ROMAIN Félix, IP
WOLKOM Sylviane, IP

La réponse immunitaire joue un rôle fondamental au cours de la tuberculose. Le contrôle de l'infection est assuré par des monocytes/macrophages dont le recrutement et l'activation dépendent de la présence des lymphocytes T spécifiques. L'absence de ces cellules, la diminution de leur nombre (par exemple durant le SIDA) permettent aux bactéries de se multiplier au sein des macrophages, des fibroblastes. Au cours de l'infection, les lésions typiques de la tuberculose, le développement des foyers infectieux contaminant d'autres personnes ont aussi pour origine des lymphocytes T. Lors de la vaccination, la réponse immunitaire protectrice ne se développe qu'après injection de bactéries vivantes de virulence atténuée. L'injection de bactéries vivantes avirulentes, ne se multipliant pas dans l'hôte, n'est pas ou peu "vaccinante". Une multiplication transitoire des bactéries est indispensable pour la vaccination. Afin de caractériser et purifier les molécules bactériennes, supports de l'immunité anti-infectieuse ainsi que de la vaccination, un double criblage de ces molécules a été e ffectué. Les protéines sécrétées par les bactéries lors de leur croissance ont été séparées sur leur capacité à être reconnues par les effecteurs de la réponse immunitaire, induits après des immunisations par des bactéries vivantes. A l'inverse, elles ont été contre-sélectionnées sur les effecteurs des réponses immunitaires, induits après injection de bactéries inactivées.



Sans titre

(Responsable non identifié)

Des molécules excrétées par les bacilles du complexe M.tuberculosis lors de leur croissance ont été purifiées en fonction de leur capacité à interagir avec les effecteurs des réponses immunitaires (anticorps ou lymphocytes T) des animaux immunisés avec des bactéries vivantes de virulence atténuée (BCG) ou infectés par M.tuberculosis. Une contre-sélection a été effectuée avec les effecteurs des réponses immunitaires induites par l'injection de bactéries tuées par la chaleur ou inactivées. Un complexe de molécules de masse moléculaire 45/47 kDa en gel SDS a ainsi été détecté sur sa capacité à interagir avec des anticorps présents dans le sérum des cobayes immunisés avec des bactéries vivantes. A partir de ces molécules purifiées, des anticorps monoclonaux et polyclonaux spécifiques ont été obtenus. Des dosages de ces molécules dans les milieux de culture et sur les bactéries montrent que leur production est dépendante de la croissance cellulaire, qu'elles représentent environ 1% des molécules sécrétées par les bactéries et moins de 0,01% de la masse bactérienne. Bien que très minoritaires en quantité, ces molécules induisent des réponses immunitaires intenses aussi bien pour la réponse en anticorps utilisés pour la sélection que pour la réponse des lymphocytes T. Une banque d'expression d'ADN de M.tuberculosis dans M.smegmatis a été éprouvée grâce aux anticorps polyclonaux spécifiques. La sélection d'un clone, suivie d'un sous-clonage dans E.coli puis d'un séquençage, a permis d'établir la séquence nucléotidique codant ces molécules, de montrer qu'un seul gène est présent dans l'ADN de M.tuberculosis, résultat confirmé par le récent séquençage du génome complet de cette espèce. La présence d'une séquence signal typique signe la destination extracellulaire de ces molécules. La surévaluation de la masse moléculaire lors de la migration en gel SDS (45/47 kDa) par rapport à la masse calculée (28780) est due à la richesse en proline (21%) de la chaîne peptidique. La présence de mannoses, liés de façon covalente à ces molécules, a été démontrée d'une part par l'analyse chimique (7 moles de mannoses par mole) et d'autre part par deux méthodes d'ionisation de spectrométrie de masse (MALDI et Electrospray) qui montrent l'existence d'une série de molécules de masse 28780 + (162)n, n étant compris en 0 et 9 avec un maximum de 7. Cette glycosylation a un rôle important pour l'activité biologique. La déglycosylation par voie chimique ou enzymatique abolit quasi totalement l'activité stimulante in vitro des lymphocytes T et les réactions d'hypersensibilité de type retardé in vivo. De même, les molécules purifiées produites par des bactéries recombinantes, Mycobacterium smegmatis ou E.coli, ont une activité immunologique très diminuée, respectivement au moins de 60% ou 95%. Des essais d'immunisation avec ces protéines purifiées, natives ou recombinantes, montrent qu'elles sont de très bons immunogènes pour la réponse en anticorps, alors que la réponse de type cellulaire est faible. Cette observation, en contradiction avec les résultats de l'immunisation par des bactéries vivantes, conduit à tenter d'améliorer les conditions de l'immunisation, du type d'adjuvant utilisé etc... L'immunisation par de l'ADN "nu" conduit de même à l'induction d'une production massive d'anticorps avec une réponse cellulaire minime. Une autre espèce moléculaire, présente dans le milieu de culture de BCG, a été également purifiée sur sa capacité à révéler des réactions d'hypersensibilité de type retardé seulement chez des animaux immunisés avec des bactéries vivantes et se multipliant chez l'animal. Ces molécules n'induisent que très difficilement des anticorps. Le criblage d'une banque d'ADN de BCG est actuellement en cours en utilisant des sondes nucléotidiques déduites de la séquence N-terminale qui a été établie. La composition très inhabituelle de ces molécules, plus de 40% de proline, très rares acides aminés basiques, en rend l'analyse difficile. Un dernier groupe de molécules, également sélectionnées en fonction des réponses immunitaires, a été purifié. Le gène codant ces protéines a rapidement été repéré dans la séquence génomique de M.tuberculosis (banque Sanger) à partir de la séquence N-terminale établie pour plus de 50 acides aminés. La présence d'une séquence signal établit que ces petites protéines (masse moléculaire 8337 Da) sont également destinées à être exportées. Leur activité biologique, révélation d'une hypersensibilité de type retardé, n'est également intense que chez les animaux immunisés avec des bactéries vivantes. Au total, cette démarche de sélection et contre-sélection de molécules excrétées par M.tuberculosis ou BCG durant la croissance a conduit à des molécules nouvelles pour leur composition ou leur structure. Leur utilisation en tant qu'antigènes éventuellement protecteurs est en cours d'essais, conjointement avec une analyse de leur structure ainsi que de leur fonction pour la bactérie.



Prior vaccination with an attenuated strain of M.tuberculosis or with the classical bacillus Calmette-Guérin (BCG) leads to an enhanced cell-mediated immunity and a strong delayed-type hypersensitivity (DTH) state towards mycobacterial extracts. Both of these immune reactions are mediated by T lymphocytes. The absence of these cells during an immunodepression syndrome, acquired (AIDS, immunosupressive drugs, etc...) or congenital (DiGeorge syndrome, absence of interferon gamma receptor, etc...), changes the disease. The typical chronic lesions from which M.tuberculosis bacteria are aerolized to other persons are absent, an unlimited bacterial growth occurs in macrophages, in fibroblasts, etc... When heat-killed bacteria or extracts are injected alone or with Freund's adjuvant, only a marginal protection or no protection towards a challenge with virulent bacteria is detectable, despite a perfect expression of DTH. A transient growth of the bacteria used to vaccinate is needed to obtain a protective immunity. In order to characterize and purify bacterial molecules which support the protective immunity, the molecules secreted by BCG and M.tuberculosis during bacterial growth were selected on the immune responses of animals receiving living bacteria. In the same time they were counterselected on the immune responses of animals receiving dead (heat-killed or infactivated) bacteria. Three groups of molecules able to interact only with the immune responses elicited by living bacteria were analyzed further.