UNITÉ DE PROGRAMMATION MOLÉCULAIRE ET TOXICOLOGIE GÉNÉTIQUE

Responsable
HOFNUNG Maurice

e-mail : mhofnung@pasteur.fr


CNRS URA 1444

Département des Biotechnologies
Institut Pasteur
25/28 Rue du Dr. Roux
75724 PARIS Cedex 15

Tél
01 45 68 88 30
Fax
01 45 68 88 34

Secrétariat

COVA-RODRIGUES Ana, IP
THIRION Mireille, CNRS

Chercheurs permanents

BACHELLIER Sophie, IP (stage post-doctoral)
BETTON Jean-Michel, CNRS
CHARBIT Alain, CNRS
CLÉMENT Jean-Marie, CNRS
DASSA Élie, INSERM
MARTINEAU Pierre, INSERM
QUILLARDET Philippe, IP
SAURIN William, CNRS
SZMELCMAN Sévec, CNRS
ROUFFAUD Marie-Ange, CNRS (détachée en Mycologie)

Stagiaires de recherche

AUTRET Nicolas, (stage dans le cadre du Magister)
BRESSANELLI Stéphane, (Etudiant, Université Paris-VII)
COUTAUCHAUD Jean-Pierre, (stage dans le cadre INA)
KHODAI-BOORAN Nasser, Boursier
LERONDEAU Véronique, DEA
MOUREZ Michaël, Thèse
RAFFY Sébastien, DEA
TAPIA Isabel, Boursière
WANG Jiang, Boursier
YAMAKADO Mitsu, (Etudiant, Collègue Rabelais)

Ingénieurs Techniciens Administratifs

BOSCUS Didier, INSERM
IRBY Marie-Louise, IP
JEHANNO Muguette, IP
LAMBERT Patricia, IP
MICHEL Valérie, IP
SASSOON-CLAVIER Nathalie, IP
TOUATI Éliette, IP

L¹Unité de Programmation Moléculaire et Toxicologie Génétique a deux axes principaux de recherche. Le premier est l¹étude d¹une région génétique complexe de la bactérie modèle Escherichia coli K12 (la région malB) et de l¹organisation, du fonctionnement, des interactions, et de la biogenèse des protéines qui lui correspondent. Le second axe aborde les effets sur les bactéries des agents capables de créer d'endommager le matériel génétique : les agents génotoxiques. Cinq des six protéines qui sont déterminées par la région malB sont localisées dans l¹enveloppe bactérienne et coopèrent pour concentrer le maltose et les maltodextrines dans la cellule. Trois des protéines sont associées à la membrane interne où elles constituent un des premiers cas connu de transporteurs ABC (pour ATP Binding Cassette). Ces transporteurs répandus dans tout le monde vivant et dont on connaît plus de 500 exemplaires, ont des spécificités de substrat extraordinairement variées et certains interviennent dans des fonctions importantes chez l¹homme. Deux protéines supplémentaires LamB et MalE, augmentent considérablement l¹efficacité de ce transporteur. LamB facilite la diffusion des substrats à travers la membrane externe, et MalE concentre le substrat dans le périplasme pour le délivrer au transporteur ABC localisé dans la membrane interne et composé des trois protéines MalF, MalG et MalK. LamB est également récepteur pour l¹adsorption du bactériophage Lambda. Pour étudier les protéines associées à l¹enveloppe nous avons mis au point une approche génétique qui nous permet de repérer les sites de ces protéines, nommés « sites permissifs », qui tolèrent des mutations, y compris des insertions ou des délétions sans perte des activités biologiques de la protéine. Dans une deuxième étape nous pouvons greffer génétiquement en ces sites des peptides étrangers « rapporteurs » qui nous permettent de sonder avec des anticorps contre ces peptides la topologie et l¹organisation fonctionnelle de la protéine. Cette approche nous a conduit également en collaboration avec l¹équipe d¹immunologie de Claude Leclerc à l¹Institut Pasteur, et avec des biophysiciens (notamment Graham Bentley pour les rayons X et Muriel Delepierre pour la RMN) à tenter de comprendre comment l¹environnement d¹un motif antigénique peut moduler ses propriétés immunologiques (antigénicité et immunogénicité) et physiques (avec aussi l¹espoir de contribuer à la méthodologie des vaccins recombinants). Enfin la région malB nous a révélé l¹existence de séquences d¹ADN hautement répétitives que l¹on considérait jusque là comme inexistantes chez les bactéries. Nous examinons l¹hypothèse qu¹elles pourraient intervenir dans l¹organisation du génome bactérien. Notre deuxième axe de recherche participe à la démarche préventive qui consiste à détecter les produits de l¹environnement capables de modifier le génome (les toxiques génétiques) et donc susceptibles d¹être mutagènes et/ou cancérogènes chez l¹homme. Après avoir mis au point le SOS Chromotest, un test bactérien simple et largement utilisé en laboratoire pour examiner le pouvoir génotoxique des produits et des rayonnements, nous nous sommes intéressés au mécanisme d¹action d¹un mutagène extrêmement puissant, un nitronaphtofuranne le R7000, représentant d¹une famille chimique utilisée en pharmacie et en agro-alimentaire.



La région malB et ses produits. La protéine LamB

(Alain Charbit)

La protéine LamB, localisée dans la membrane externe, fait partie de la grande famille des porines, qui contrôlent, en général suivant leur taille, la diffusion des produits hydrophiles à travers la membrane externe des bactéries Gram- . LamB a en plus une spécificité : elle favorise la diffusion des maltodextrines - c¹est une maltoporine - par un mécanisme qui fait intervenir au moins un site de liaison réversible. Comme nous l¹avons déjà signalé LamB joue également le rôle de récepteur spécifique pour des bactériophages, dont le phage Lambda. Nos connaissances génétiques biochimiques et immunologiques font de LamB la porine spécifique probablement la mieux comprise. C¹est une des rares protéines intégrale de membrane dont la structure aux rayons X soit connue (depuis 1995). Sa forme active est un trimère. Chaque monomère est constitué d¹un tonneau béta formé par dix-huit brins béta antiparallèles consécutifs. Après avoir en partie élucidé la topologie fonctionnelle de la protéine par des approches génétiques et immunochimiques, nous concentrons nos efforts sur l¹élucidation du mécanisme moléculaire de la diffusion facilitée spécifique, ainsi que sur le mécanisme d¹adsorption des phages. Nos travaux récents montrent en particulier qu¹en plus du site de fixation du substrat identifié par la génétique et par la cristallographie aux rayons X et localisé dans le canal constitué par le tonneau béta, les boucles localisées en surface de la bactérie interviennent dans la diffusion facilitée. Après avoir mis en évidence ce phénomène surprenant, nous cherchons à en préciser le mécanisme moléculaire. Nous cherchons également à préciser par quel mécanisme se produit d¹adsorption du phage et l¹injection de son ADN. Au cours des années récentes, nous avons identifié des résidus de la protéine terminale du phage ( la protéine J) dont la modification entraîne une extension de la spécificité d¹hôte du phage. L¹analyse génétique nous a conduit à proposer que l¹interaction entre le phage et le récepteur faisait sans doute intervenir une structure préalable au site de fixation lui-même. D¹autre part, l¹injection de l¹ADN du phage requiert en plus de la protéine LamB, la présence de deux protéines de membranes interne : le complexe IIC/IID Man de la perméase à mannose d¹Escherichia coli. En collaboration avec le groupe de George Rapoport à l¹Institut Pasteur, nous avons montré que la perméase fructose-spécifique de l¹opéron levanase de Bacillus subtilis pouvait complémenter les mutations dans la perméase à mannose d¹Escherichia coli dans leur participation à l'infection par le phage Lambda. Cela suggère que le phage reconnaît une architecture commune de « canal » dans la membrane interne plutôt que des déterminants spécifiques de protéines.

MalE, interactions avec MalFGK2 et avec le substrat.

(Sevec Szmelcman).

MalE est une protéine périplasmique soluble qui se présente comme une structure ouverte à deux lobes. Cette structure lie le substrat par rapprochement des deux lobes. La structure de la protéine ouverte et fermée est connue par diffractions des rayons X. MalE intervient non seulement dans le transport des maltodextrines grâce à ses interactions avec le transporteur ABC de la membrane interne composée des trois protéines MalF, MalG et MalK (stoechiométrie FGK2) mais aussi dans la chémotaxie grâce à ses interactions avec le récepteur Tar de la membrane interne. Nos travaux se sont concentrés sur la recherche de résidus localisés dans une région particulière, l¹hélice alpha 7, dont nous avions montré par le passé qu¹elle intervenait très probablement directement dans l¹interaction avec les protéines de la membrane interne. Plusieurs résidus indispensables à cette interaction ont été identifiés. La recherche de mutations suppresseurs de l¹effet de ces résidus a permis d¹identifier des mutations dans une boucle de la protéine MalF. Cette boucle est donc un candidat sérieux pour l¹interaction avec l¹hélice alpha7 de MalE. Enfin nous avons réussi à créer une mutation par mutagénèse dirigée d¹un résidu localisé dans la charnière entre les deux lobes qui bloque la protéine dans sa configuration ouverte comme l¹a confirmée l¹analyse aux rayons X (collaboration avec Graham Bentley).

MalE, son repliement dans le périplasme.

(Jean Michel Betton)

Nous avions dans le passé caractérisé un mutant Mal-, MalE31, qui correspond à la double substitution G32D, I33P dans la séquence mature de MalE à un endroit définissant un coude structural alpha beta. Différentes approches nous ont permis de montrer que dans ce mutant la protéine mature forme des corps d¹inclusion dans le périplasme. De plus, après délétion de la séquence signal, MalE31 forme des corps d¹inclusion dans le cytoplasme et induit une réponse type choc thermique liée au facteur sigma32 qui a pour conséquence d¹induire la synthèse des chaperons DnaK et GroE et de supprimer partiellement l¹agrégation de la protéine. Par contre l¹agrégation spécifique de MalE31 dans le périplasme induit une réponse type choc thermique qui dépend du facteur sigma 24. Ce type de réponse cellulaire est typique d¹un « stress » extra-cytoplasmique. Grâce à cette observation et en collaboration avec Dominique Missiakas et Satish Raina (Genève), des supresseurs extra-géniques de l¹agrégation périplasmique de MalE31 ont été recherchés. Deux gènes (surA et fkpA) codant pour des peptidyl-prolyl-isomerases ont été ainsi isolés. Il est important de noter qu¹après dénaturation des corps d¹inclusion par l¹urée 8 molaires et renaturation la protéine MalE31 peut être purifiée par chromatographie d¹affinité sur une colonne d¹amylose. In vitro, MalE31 présente une affinité pour le maltose identique à celle de la protéine sauvage, ce qui montre que la mutation originale n¹affecte pas la structure fonctionnelle de MalE mais bien son repliement cellulaire. Une étude génétique et biochimique de ce repliement est bien avancée et fait de la protéine MalE un très bon modèle pour les relations entre l¹exportation et le repliement d¹une protéine.

Le complexe MalFGK2.

(Elie Dassa)

En partie grâce à nos travaux, ce complexe est un des mieux compris parmi les transporteurs ABC dont on connaît aujourd¹hui plusieurs centaines. Ces transporteurs couplent directement l¹énergie d¹hydrolyse de l¹ATP au transport de molécules. Ils possèdent en commun un module protéique ³énergétique³ d¹environ 220 résidus appelé domaine ABC et qui est porté ici par la protéine MalK. Ce module est capable de fixer et d¹hydrolyser l¹ATP. Nous cherchons à comprendre le mécanisme fonctionnel de la translocation dépendante de l¹ATP du maltose dans le cytoplasme ainsi que les règles d¹assemblage du complexe MalFGK2. Cette étude est rendue délicate par le caractère fortement hydrophobe des protéines MalF MalG, par leur faible expression et par l¹absence d¹une épreuve fonctionnelle pour les protéines isolées. Toutefois l¹approche génétique nous permet de tenter de définir les sites fonctionnels de ces protéines et de caractériser les interactions qu¹elles engagent lors du transport. Nos principaux résultats récents concernent une boucle hydrophile conservée dans les protéines hydrophobes que nous avions découverte il y a quelques années. Elle est nommée EAA en référence à certains résidus qu¹elle contient. Elle constitue sans doute un site de reconnaissance pour l¹ATPase des systèmes ABC. Les mutations isolées dans cette région affectent le transport sans modifier la stabilité globale ni l¹insertion dans la membrane des protéines touchées. Ces mutations affectant la fonction se répartissent en deux classes. Dans la première, la protéine MalK normalement liée à la membrane cytoplasmique par l¹interaction avec MalF et MalG est retrouvée dans la fraction soluble cytoplasmique. Dans la deuxième, la localisation cellulaire de MalK n¹est pas affectée. Cela suggère fortement que la région EAA constitue directement ou indirectement un site de reconnaissance pour l¹ATPase de MalK. A partir de ces mutants EAA nous avons isolé des suppresseurs capables de restaurer le transport et localisés dans le gène malK. La restauration du transport est accompagnée de la restauration de la localisation membranaire normale de la protéine MalK dans les mutants où elle était devenue cytoplasmique. Cela suggère que les mutants qui conservent une localisation cellulaire normale de MalK seraient affectés dans une interaction fonctionnelle avec cette protéine. Notre hypothèse est que la région EAA pourrait jouer un double rôle : un site de reconnaissance permettant l¹attachement de MalK à la membrane, et une région par laquelle seraient transmis des signaux permettant à MalK de réaliser le couplage du transport du maltose à l¹hydrolyse de l¹ATP. Enfin l¹analyse des relations séquence-fonctions de la protéine MalF ainsi que ses interactions avec la protéine MalG sont bien avancées.

Evolution et phylogénie.

(Elie Dassa)

Nous avons développé une série de travaux à partir des banques de séquences pour étudier l¹évolution des différents systèmes analogues au système de transport du maltose. Ainsi par exemple, l¹examen de la banque des séquences de Mycoplasma genitalium nous a permis de retrouver les protéines affines de transport de cet organisme qui semblaient avoir disparu au cours de l¹évolution. Nos études sur l¹évolution des ABC nous a conduits à des données phylogénétiques remarquables, puisqu¹elles s¹interprètent en disant que les systèmes de transport ABC appartiennent à deux branches distinctes suivant qu¹ils sont importeurs ou exporteurs. Ainsi on peut imaginer que la ségrégation entre importeurs et exporteurs a eu lieu dans la cellule primordiale. Enfin, la comparaison des arbres phylogénétiques des protéines intégrales de membranes de ces transporteurs avec celui des cassettes ABC, et celui des protéines affines a montré qu¹ils étaient congruents et que ces différents éléments avaient ainsi sans doute co-évolué.

Vecteurs et immunologie de protéines recombinantes. L¹identification de sites permissifs dans une protéine nous a ouvert la voie à la construction de vecteurs d¹expression que nous utilisons à deux fins principales. Propriétés immunologiques des protéines

(Alain Charbit).

Nous comparons l¹antigénicité et l¹immunogénicité d¹un même peptide inséré génétiquement en différents sites permissifs d¹une protéine. Nous utilisons LamB et MalE comme protéines porteuses pour exprimer ces épitopes étrangers. Nous pouvons ainsi étudier l¹influence sur les propriétés immunologiques (antigénicité, immunogénicité) de la localisation exacte d¹un épitope au sein d¹une protéine (ciblage moléculaire), de la nature du compartiment cellulaire dans lequel il est exprimé (ciblage cellulaire), et de la présence voisine ou non d¹autres épitopes (collaboration avec l¹Unité de Biologie des Régulations Immunitaires de Claude Leclerc à l¹Institut Pasteur) et de sa conformation [collaboration avec les Unités de Cristallographie - (Graham Bentley) et de RMN (Muriel Delpierre) de l¹Institut Pasteur]. Ainsi dans le cas d¹un épitope particulier (épitope C3 du poliovirus) inséré en 11 sites permissifs de la protéine MalE nous avons pu récemment comparer l¹antigénicité (liaison à des anticorps spécifiques), l¹immunogénicité (capacité à induire des anticorps antipeptides) et la mobilité (mesurée par RMN). Cela nous a conduit à une hypothèse de travail sur les relations entre ces trois paramètres. L¹ensemble des observations que nous avons faites (en collaboration étroite avec Claude Leclerc) ont des implications pour la confection de vaccins recombinants. Toutefois, il faut noter que notre travail, dont nous pensions au départ qu¹il pouvait déboucher rapidement sur des approches vaccinales, a surtout révélé un nombre important de paramètres qu¹il faudra pouvoir maîtriser pour pouvoir déboucher sur des vaccins confectionnés à partir d¹épitopes exprimés dans des protéines recombinantes. Vecteur de présentation, vecteur d¹exportation/purification.(Jean Marie Clément, Sevec Szmelcman) Comme présentatrice ³d¹épitopes³, les protéines LamB et MalE ont été utilisées par exemple pour l¹expression d¹épitopes de l¹enveloppe du virus HIV1. Les bactéries recombinantes (E. coli, Salmonella typhymurium atténuée) ainsi que les protéines hybrides purifiées ont été testées pour leur capacité à induire des anticorps neutralisant le virus HIV1. Les titres anti-peptides sont élevés pour certains épitopes mis en tandem, et des expériences pour examiner la neutralisation sont en cours. D¹autre part les résultats prometteurs ont été obtenus dans le cadre d¹un contrat européen avec un épitope du virus de la gastroentérite porcine (TGEV) exprimé dans MalE. Enfin notons que la protéine MalE nous a permis de produire la partie soluble V1 V2 du récepteur CD4. La protéine hybride MalE CD4 est capable de lier le virus in vitro. Une série de dérivés portant diverses portions ou répétitions de CD4 a été confectionnée afin de tenter de trouver des hybrides plus actifs contre le virus.

Séquences hautement répétées.

(Sophie Bachellier)

En 1982 nous avions découvert dans la région malB la première famille de séquences hautement répétitives et palindromiques chez une bactérie, les unités palindromiques ou UP. Ces séquences toujours extra géniques sont présentes chez d¹autres entérobactéries (notamment chez Klebsiella), et leur séquence et leur localisation révèlent une spécificité d¹espèce. Leur haute conservation nous a conduit à l¹idée qu¹elle pouvait jouer un rôle dans l¹organisation du nucléoide bactérien. Nous avons pu mettre en évidence au moins deux protéines capables de se lier à ces unités palindromiques. L¹une est l¹ADN polymérase I. L¹autre n¹est pas encore identifiée. Nous avons pu montrer que ces séquences palindromiques étaient une partie d¹un nouvel élément génétique bactérien qui a la propriété remarquable d¹être mosaïque et que nous avons appelé BIME (pour Bacterial Interpersed Mosaïque Element). Il existe au moins deux classes de BIME qui se distinguent par leur organisation génétique et leur capacité différente à se lier à la DNA gyrase et au facteur IHS (Integration Host Factor). Nous avons également montré que les BIME subissaient des variations de taille d¹une souche d¹E. coli à une autre (effet ³accordéon³). Enfin nous avons découvert une séquence d¹insertion nouvelle (IS1397) qui présente une spécificité d¹insertion absolue dans la boucle des UP. Nous recherchons si cette IS joue un rôle dans la diffusion des BIME.

Toxicologie Génétique

(Responsable non identifié)

Notre deuxième axe de recherche participe à la démarche préventive qui consiste à détecter les produits de l¹environnement capables de modifier le génome (les toxiques génétiques) et donc susceptibles d¹être mutagènes et/ou cancérogènes chez l¹homme. Après avoir mis au point le SOS Chromotest, un test bactérien simple et largement utilisé en laboratoire pour examiner le pouvoir génotoxique des produits et des rayonnements, nous nous sommes intéressés au mécanisme d¹action d¹un mutagène extrêmement puissant, un nitronaphtofuranne le R7000, représentant d¹une famille chimique utilisée en pharmacie et en agro-alimentaire. SOS Chromotest. (Philippe Quillardet, Eliette Touati). A partir d¹une souche d¹E. coli K12 qui porte une fusion génétique entre le gène lacZ de la béta galactosidase et le gène sfiA qui est sous contrôle du répresseur lexA du système SOS, nous avions proposé en 1982 un nouveau test de toxicologie génétique, le SOS chromotest. Il permet d¹évaluer de façon colorimétrique et quantitative l¹aptitude d¹un agent à endommager l¹ADN. Nous avons poursuivi nos travaux sur ce test avec deux objectifs principaux : d¹une part continuer à le valider pour en faire un test accepté par les autorités règlementaires internationales et utilisable en routine pour le contrôle des produits chimiques, et d¹autre part le perfectionner pour élargir le champ de son usage et en faire un outil génétique simple pour caractériser le mode d¹action chimique des agents génotoxiques. Nitrofurannes.(Eliette Touati, Philippe Quillardet).Les nitrofurannes sont des produits largement utilisés en pharmacie et en agro-alimentaire. Au cours d¹une expertise nous avions découvert qu¹un naphto nitrofuranne, le 2- nitro - 7 -methoxy - naphto - (2,1-b) furanne ou R 7000 était un des mutagènes les plus puissants pour les bactéries. Nous avons choisi de l¹étudier de façon approfondie pour les raisons suivantes. D¹une part nous voudrions élucider les raisons de son activité extrême. D¹autre part nous voudrions en faire un modèle pour comparer les activités génotoxiques vis à vis des bactéries avec les effets réels de l¹utilisation de produits de cette famille chez l¹homme. Au moins neuf modifications nucléotidiques (adduits) qui peuvent être éliminés à vitesse variable par exision réparative, sont induits par le produit. Les résidus guanine constituent les sites préférentiels de formation de ces adduits. La spécificité mutagénique du R 7000 a été déterminée dans le gène lacI d¹E. coli. 80% de ces mutations sont situées dans des paires de base G:C et concernent en proportions égales des évènements de substitution et de délétion d¹une paire de base. Nous avons progressé dans l¹analyse de la localisation des sites de lésion par le R 7000 et d¹autres naphto nitrofurannes, en prenant toujours pour cible le gène lacI et en reliant les lésions à la fréquence des mutations dans ces mêmes régions. Nous avons également mis en évidence une induction des réponses au stress oxydatif qui suggère qu¹un effet du produit pourrait faire intervenir des ions superoxides.



The Unit of Molecular Programming and Genetic Toxicology has two main research axes. The first one is the study of a complex genetic locus of the model bacterium Escherichia coli K12 (the malB region) and of the organization, the functioning, the interactions and the biogenesis of the corresponding proteins. The second axis is the study of the effects on bacteria of agents able to damage the genetic material, the so-called genotoxic agents. Five of the six proteins encoded by the malB region are located in the cell envelope and cooperate to concentrate maltose and maltodextrins into the cell. Three of the proteins are associated with the inner membrane where they constitute one of the first discovered ABC transporter (ATP Binding Cassette). These transporters are found in all the living world (over 500 are known) and have specificities for a huge variety of substrates. Some of them play a role in important functions in man. Two supplementary proteins, LamB and MalE, increase considerably the efficiency of this transporter. LamB facilitates the diffusion of the substrate through the outer membrane, and MalE concentrate the substrate into the periplasm and delivers it to the ABC transporter associated with the inner membrane and composed of the three proteins MalF, MalG and MalK. LamB is also the receptor for the adsorption of bacteriophage Lambda. In order to study the proteins associated with the cell envelope, we have developed a genetic approach to locate « permissive sites » in proteins. These sites tolerate mutations, including insertions or deletions, without loss of the biological activities of the protein. In a second step we can insert genetically into these sites foreign reporter peptides and examine with antibodies against the peptides the topology and the functional organization of the protein. This approach led us to initiate a collaboration with Claude Leclerc, an immunologist at the Institute Pasteur and with biophysicists (Graham Bentley for X ray crystallography and Muriel Delepierre for NMR) in order to understand how the molecular environment of an antigenic motif may influence its immunologic properties (antigenicity and immunogenicity) and its biophysical properties with the hope to draw some consequences useful for recombinant vaccines. Finally, the malB region revealed to us the existence of highly repetitive sequences which were believed not to exist in Escherichia coli. We examine the hypothesis that they could play a role in the organization of the bacterial nucleotid . Our second line of research is intended to participate in the prevention of the action of environmental agents able to damage DNA (genotoxic agents) and thus likely to be mutagenic and carcinogenic to man. After having invented and validated a simple bacterial short term test, the SOS Chromotest, to measure the ability of chemicals and radiation to harm the genetic material, we focused our attention on the mode of action of a nitronaphtofuran (called R7000), which is an extremely powerful mutagen, belonging to a chemical series, some members of which are used as pharmaceuticals or food and feed additives.