UNITÉ DE PHYSIOLOGIE CELLULAIRE

Responsable
SCHWARTZ Maxime

e-mail : secrétariat:mferrand@pasteur.fr>


CNRS URA 1300

Département des Biotechnologies
Institut Pasteur
25/28 Rue du Dr. Roux
75724 PARIS Cedex 15

Tél
01 4568 8816
Fax
01 4568 8790

Secrétariat

FERRAND Monique, IP

Chercheurs permanents

BEGUIN Pierre, IP
CHAUVAUX Sylvie, IP
DELEPELAIRE Philippe, CNRS
ELMERICH Claudine, IP
GHIGO Jean-Marc, IP
KAMINSKI Pierre-Alexandre, IP
WANDERSMAN Cécile, IP
ZAMAROCZY (de) Miklos, CNRS

Stagiaires de recherche

ARSENE Florence, Post-doc
BERTIN Stéphane, Thèse
BINET Rachel, Thèse
CARRARD Géraldine, DEA
CARRENO LOPEZ Ricardo, Thèse
GAILLON Laurent, stage
HASSAN Uzma
KULA Christelle, DEA
LEIBOVITZ Emmanuelle, Thèse
MICHEL-REYDELLET Nathalie, Thèse
PAULIC Laurent, stage
PEREG Lily, Thèse
SAPRIEL Guillaume, stage

Ingénieurs Techniciens Administratifs

CHAVEROCHE Marie-Kim, IP
DESNOUES Nicole, IP
GUGLIELMI Gérard, CNRS
LECUBARRI (de) Raphaël, IP
LETOFFE Sylvie, IP
LONGIN Robert, IP
MEIER Alain, IP
MIRAS Isabelle, IP
PAQUELIN Annick, CNRS

L'Unité de Physiologie Cellulaire s'intéresse à plusieurs phénomènes biologiques impliqués dans la nutrition des microorganismes, leur dissémination et leur interaction avec les milieux environnants. Un premier groupe étudie les bactéries fixatrices d'azote associées aux plantes; un deuxième, une bactérie cellulolytique impliquée dans le recyclage du carbone de la biomasse et un troisième groupe étudie la sécrétion des protéines extracellulaires chez les bactéries à Gram négatif. Les trois groupes utilisent des approches de biologie moléculaire et de biochimie pour comprendre les mécanismes moléculaires mis en oeuvre.



Fixation de l'azote et interactions bactéries-plantes

(C. Elmerich)

La fixation biologique de l'azote, qui joue un rôle majeur dans le cycle de l'azote, est une propriété limitée aux seuls procaryotes. Les bactéries fixatrices d'azote possèdent un complexe enzymatique, appelé nitrogénase, qui assure la réduction de l'azote moléculaire en ammoniaque. Ces bactéries présentent une très grande diversité dans leur mode de vie et leur association avec les végétaux. Les plus efficaces sont celles qui s'associent avec les plantes par l'intermédiaire de structures différenciées de l'hôte, comme par exemple les nodosités des légumineuses. D'une manière schématique, la transcription des gènes de la fixation de l'azote (gènes nif ) n'a lieu que dans des conditions physiologiques bien définies qui dépendent des propriétés des bactéries concernées. Les signaux majeurs intervenant dans cette régulation sont l'ammoniaque et l'oxygène. Dans la majorité des cas l'expression des gènes nif dépend d'un activateur de la transcription appelé NifA et d'un facteur sigma spécifique, produit de rpoN, qui reconnaît des promoteurs particuliers en amont des opérons nif. De grandes variations existent, selon les genres bactériens, dans la régulation de la transcription et de la traduction de nifA, ainsi que dans les mécanismes de modification post-traductionnelle de NifA. Les recherches portent sur deux systèmes d'intérêt agronomique. L'un concerne une association symbiotique vraie entre une légumineuse et Azorhizobium caulinodans, l'autre concerne la biologie des bactéries du genre Azospirillum, qui s'associent aux céréales. A. caulinodans forme des nodosités fixatrices d'azote à la fois sur les racines et sur les tiges de la légumineuse tropicale Sesbania rostrata, et fixe également l'azote dans les conditions non-symbiotiques. Chez Azospirillum brasilense on a montré, que NifA est exprimé en présence d'ions ammonium et d'oxygène, conditions incompatibles avec la fixation de l'azote. Ceci laisse supposer que NifA peut exister sous deux formes, active et inactive, et que l'activité de NifA est régulée de manière post-traductionnelle. Les travaux réalisés cette année ont permis de mettre en évidence que la cible du contrôle par l'ammoniaque correspond à la partie N-terminale de NifA et que la protéine PII, produit du gène glnB, joue un rôle dans cette régulation. Les études génétiques et biochimiques visant à caractériser le gène glnB et son produit, PII, ont aboutit à la caractérisation d'un second gène, appelé glnZ , très homologue à glnB. L'inactivation de chacun des deux gènes ainsi que la construction de double mutants, a permis de montrer que seul glnB est essentiel pour la fixation de l'azote. La caractérisation du gène glnB a été également effectuée chez A. caulinodans. Les études ont permis de montrer que ce gène n'est pas requis pour la fixation de l'azote à l'état libre tandis qu'il est essentiel pendant la symbiose avec la plante hôte. Chez A. caulinodans on a poursuivi l'étude du rôle d'une protéine affine de l'ARN, NrfA dans le contrôle de la fixation de l'azote. Les travaux en cours visent à élucider comment NrfA contrôle l'expression de nifA et à quel niveau s'exerce le contrôle par NrfA et par l'ammoniaque. Les travaux sur la colonisation des racines de blé par Azospirillum ont été continués. Les bactéries à la surface de la racine présentent une morphologie ressemblant à des cystes, une forme de différenciation observée également à l'état libre. L'étude d'un mutant qui reste sous la forme végétative en association avec la plante a permis d'identifier un gène de régulation qui contrôle le processus de différenciation et de colonisation des racines.

Dégradation de la cellulose

(P. Béguin)

La cellulose est le polysaccharide le plus abondant présent dans la biomasse végétale. Sa dégradation par les cellulases constitue l'un des processus majeurs du cycle du carbone dans la biosphère. La cellulose représente également une source potentiellement importante de solvants et de carburants (acétone, butanol, éthanol, acide acétique etc.) pouvant être obtenus par fermentation à partir du glucose résultant de son hydrolyse. De plus, un certain nombre d'applications plus ponctuelles des cellulases sont apparues récemment, telles que le prétraitement des fourrages pour l'ensilage, la clarification des jus de fruits ou l'utilisation comme additif aux lessives. Clostridium thermocellum, bactérie anaérobie thermophile et sporogène étudiée dans l'Unité, synthétise un complexe cellulasique dont l'activité spécifique est très élevée. Ce complexe, dénommé cellulosome, est d'abord localisé à la surface des cellules, où il est responsable de l'adhérence des bactéries au substrat, puis il est relargué dans le milieu de culture. D'une masse moléculaire atteignant 2 - 4 MDa, il comprend au moins quinze sous-unités différentes. On suppose que l'agencement spatial de ces composants contribue de manière essentielle à l'activité vis-à-vis de la cellulose cristalline. Notre travail porte actuellement sur trois aspects. En collaboration avec l'Unité d'Immunologie Structurale (pour la partie cristallographique), nous tentons de définir le mécanisme réactionnel d'hydrolyse des liaisons ß-glycosidiques par les différents types de cellulases et de xylanases présentes dans le cellulosome. Ce travail a abouti à la caractérisation structurale et fonctionnelle des endoglucanases CelA, CelC, CelD et de la xylanase XynZ .Nous étudions par ailleurs les principes qui gouvernent l'organisation des diverses sous-unités à l'intérieur du cellulosome. Nous avons montré que les sous-unités catalytiques comportent un domaine d'ancrage conservé, constitué d'un segment dupliqué de 22 résidus, appelé domaine dockerine. Ce segment permet la fixation des enzymes sur une protéine d'échafaudage, appelée CipA, qui porte une série de domaines récepteurs (domaines cohésine) complémentaires. L'un de ces domaines cohésine a été purifié et cristallisé et l'étude de sa structure tridimensionnelle est en cours, en collaboration avec l'Unité d'Immunologie Structurale. Nous avons également purifié, en vue de déterminer sa structure, un complexe entre un domaine cohésine et le domaine dockerine de l'endoglucanase CelD. Pour terminer, nous avons abordé l'étude des composants de la surface cellulaire de C. thermocellum, afin de tenter de comprendre comment celle-ci est organisée et comment s'y intègre la morphogénèse du cellulosome. Nous avons identifié plusieurs gènes codant pour des polypeptides permettant probablement l'ancrage à la surface de la bactérie de composants catalytiques individuels ou de cellulosomes. En effet, certains de ces polypeptides contiennent un domaine cohésine qui reconnaît le domaine dockerine porté par les (hémi)cellulases individuelles. D'autres comportent un domaine cohésine différent, fixant un domaine dockerine de séquence apparentée, mais de spécificité de liaison distincte, porté par CipA. Par ailleurs, ces polypeptides contiennent également un segment tripliqué commun, appelé domaine SLH, qui confère aux protéines qui le portent la capacité de se fixer au peptidoglycane. En collaboration avec la Station de Microscopie Electronique, nous avons confirmé qu'au moins trois des polypeptides porteurs d'un domaine SLH étaient bien localisés à la surface des cellules de C. thermocellum. Nous avons également montré que la protéine de couche S de C. thermocellum comporte un segment polypeptidique présentant une similitude éloignée avec les domaines SLH. Ce domaine est responsable de l'attachement de la protéine de couche S à la paroi cellulaire.

Sécrétion des protéines extracellulaires chez les bactéries à Gram négatif par les ABC transporteurs

(C. Wandersman)

Parmi les différentes stratégies développées par les bactéries à Gram négatif pour sécréter des protéines dans le milieu extracellulaire à travers les deux membranes qui délimitent ces organismes, il existe une voie réservée à des protéines dépourvues de peptide signal N-terminal caractérisée par la présence, dans le transporteur, d'une ATPase membranaire. Ces ATPases ont un domaine N-terminal hydrophobe peu conservé et un domaine cytoplasmique hydrophile portant le site de fixation de l'ATP très conservé constituant en quelque sorte une cassette protéique constante d'où le nom de protéines ABC (pour ATP Binding Cassette). Elles appartiennent à une famille de protéines impliquées dans le transport de divers substrats dans des cellules très variées, les plus connues étant la protéine MDR de mammifère qui confère une multirésistance aux drogues, le produit du gène humain CFTR qui forme un canal à chlore et dont le dysfonctionnement est responsable de la mucoviscidose, et également les protéines TAP1 et TAP2 du système MHC-I responsables de la translocation des peptides endogènes à travers le réticulum endoplasmique. Le groupe étudie cette voie de sécrétion de protéines chez les bactéries à Gram négatif et a contribué à montrer que cette voie de sécrétion était présente chez plusieurs espèces bactériennes et qu'elle permettait la sécrétion de nombreuses protéines comme des toxines, des protéases, des lipases et des hémoprotéines sécrétées par Serratia marcescens et Pseudomonas aeruginosa et requise pour l'utilisation de l'hème libre ou lié à une hémoprotéine. Ces protéines n'ont pas de peptide signal N-terminal et ont, dans la majorité des cas, un signal C-terminal d'environ 50 acides aminés nécessaire et suffisant pour promouvoir la sécrétion de la protéine ou d'un polypeptide passager placé à l'extrémité N-terminale de l'hybride. Nous avons comparé les différents transporteurs entre eux et établi que le transporteur est toujours constitué de trois protéines: la protéine ABC localisée dans la membrane interne qui interagit avec deux autres protéines auxiliaires, l'une localisée aussi dans la membrane interne l'autre dans la membrane externe. L'étude de transporteurs hybrides fonctionnels a permis de montrer que le signal reconnaît la protéine ABC et que l'activité ATPasique de celle-ci est modulée par son interaction avec les substrats. Par chromatographie d'affinité, il a été possible de copurifier ces substrats en association avec les trois protéines constituant le transporteur. Ainsi nous avons pu montrer que l'association est ordonnée et qu'elle nécessite une interaction "in vivo" entre la protéine ABC et son substrat, l'exoprotéine. Cette interaction pourrait conduire à une modification conformationnelle de la protéine ABC lui permettant de s'associer aux deux autres protéines du transporteur. L'ATP semble requis pour cette deuxième étape d'association. L'étude de la sécrétion d'un exopolypeptide par cette voie a mis en évidence, pour la première fois, le rôle essentiel d'un chaperon cytoplasmique dans ce processus. Ceci suggère fortement que les protéines empruntant cette voie doivent adopter une structure dépliée pour être reconnue par le transporteur. L'étude de la fonction d'une protéine sécrétée par la voie ABC a permis l'identification d'un nouveau système d'acquisition de l'hème et de l'hémoglobine présent chez Serratia marcescens et Pseudomonas aeruginosa qui a la particularité de faire intervenir une hémoprotéine extracellulaire capable de capter l'hème et de le délivrer à un récepteur spécifique de membrane externe. La présence d'une telle voie chez des expèces phylogénétiquement éloignées montre que ce mécanisme a une portée générale.

Activité de service et de recherche appliquée

Le Laboratoire des Fermentations (R. Longin), qui fait partie de l'Unité de Physiologie Cellulaire, a poursuivi ses activités de service qui consistent notamment en cultures pour des laboratoires de l'Institut Pasteur ou des laboratoires extérieurs, et des activités de recherche et développement -avec des contrats européen ou industriels-, telles que : optimisation des conditions de cultures et de production, cultures continues automatisées etc... Pour l'année 1997, le laboratoire a réalisé : 100 cultures (57 de 2 litres, 37 de 15 l, 6 de 300 l), pour 13 Unités de l'Institut Pasteur et 6 Laboratoires extérieurs publics ou privés. Les 61 cultures d'Escherichia coli recombinants (classement en L1) ont été conduites en conditions normales, à moyenne ou haute densité optique (DO 30 à 80) ; 29 cultures ont porté sur la production d'enzymes industriels. Les autres cultures ont porté sur Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Lactobacillus farciminis, Synechococcus elongatus. Le laboratoire est spécialisé dans la culture de souches exigeant des conditions particulières (anaérobiose stricte, thermophilie, fixation de l'azote, bactéries luminescentes...). Un contrat Eurofan a commencé en 1996 et se termine en mai 98. Il consiste à comparer à l'aide de cultures cycliques automatisées les propriétés de croissance de souches sauvages et mutantes de Saccharomyces cerevisiae dont le génome complet vient d'être séquencé. Un module original et performant de mesure de la turbidité en continu a été mis au point et a été breveté. Il permet de mesurer entre 0,25 et plus de 75 unités de DO. Par ailleurs, le laboratoire a continué à mettre au point des systèmes de cultures automatisées de petits volumes (10 à 60 ml) permettant la sélection, l'enrichissement, l'évolution ou l'étude physiologique de souches microbiennes (croissance sur de nouveaux substrats, à des températures non permissives, résistance à des produits toxiques, obtention de souches floculantes...). Dans le cadre d'une collaboration entre notre Laboratoire et le Laboratoire de Génétique Moléculaire des Microorganismes de l'INSA de Lyon (Philippe Lejeune), nous avons isolé un mutant d'E. coli K12 à partir de la paroi d'un fermenteur de cultures cycliques. Cette souche est capable, en 24 heures, de développer des biofilms visibles à l'oeil nu sur n'importe quel type de surface inerte. La mutation (adr101) touche un gène de régulation (ompR) et provoque la surproduction de pili particuliers : les "curli". Il a été possible d'inactiver la production de curli (par insertion d'un transposon dans le gène de structure) et donc de supprimer le phénotype d'adhérence.



The Cellular Physiology Unit (M. Schwartz) is concerned with several biological mechanisms involved in the nutrition of microorganisms, as well as their spreading and interaction with natural environment. A first group studies nitrogen fixation. A second group studies the degradation of cellulose by the anaerobic and thermophilic bacterium Clostridium thermocellum and a third group studies protein secretion in Gram-negative bacteria by a signal peptide independent mechanism, dedicated to exoproteins having a C-terminal secretion signal. The three grpips use molecular biological and biochemical approaches to understand the molecular mechanisms involved in each case. The Fermentations Laboratory (R. Longin) which is part of the Cellular Physiology Unit, provides cultures for laboratories within and outside Institut Pasteur, and pursues research activities such as optimlization of culture conditions and automatized continuous cultures.