UNITÉ DE PHARMACOLOGIE CELLULAIRE

Responsable
VARGAFTIG B. Boris

e-mail : vargafti@pasteur.fr


INSERM U485

Département de Physiopathologie
Institut Pasteur
25/28 Rue du Dr. Roux
75724 PARIS Cedex 15

Tél
01 4568 8682 / 8687
Fax
01 4568 8703

Secrétariat

LEFAUCHEUX Corinne, IP
VILLENEUVE Josiane, IP

Chercheurs permanents

BENHAMOU Marc, INSERM
CHIGNARD Michel, INSERM
HATMI Mohamed, IP
PIDARD Dominique, CNRS
PRETOLANI Marina, IP
TOUQUI Lhoussein, IP
VARGAFTIG B. Boris, IP

Ingénieurs Techniciens Administratifs

BALLOY Viviane, INSERM
BERMAN Bruce, IP
DUMAREY Claude, IP
HAVET Nathalie, IP
JOSEPH Danielle, CNRS
LEDUC Dominique, IP
LEFORT Jean, IP
MAMAS Suzanne, IP
MEMBRILLERA José, IP
NAHORI Marie-Anne, IP
RUFFIE Claude, IP
SAHLI Fatima, IP
SINGER Monique, INSERM

Les recherches de l'Unité ont pour but de disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires des maladies pulmonaires aiguës et chroniques, d'origine allergique ou pas. Notre approche consiste à associer l'expérimentation sur des modèles animaux à l'étude des fonctions cellulaires animales et humaines ex vivo et in vitro, afin de corréler le processus pathologique à la réponse cellulaire altérée. Ces processus impliquent la participation de différentes cellules (plaquettes, monocytes, lymphocytes, cellules endothéliales et épithéliales, macrophages alvéolaires), la libération d'enzymes inflammatoires (protéinases et phospholipases), de substances chimioattractantes (cytokines, chimiokines et médiateurs lipidiques) et l'expression de molécules d'adhérence. Nous nous intéressons plus particulièrement aux mécanismes de recrutement et d'activation des granulocytes (éosinophiles et neutrophiles, plus récemment basophiles) dans le tissu pulmonaire et à leurs conséquences sur les tissus et les fonctions motrices bronchopulmonaires. La recherche de l'Unité suit trois directions principales: l'étude des mécanismes de l'hyper-éosinophilie et de l'hyperréactivité bronchique expérimentale, en tant que modèle d'asthme; l'étude de l'expression des protéinases et anti-protéinases lors de l'activation des neutrophiles en tant que modèles des événements cellulaires du syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA); l'étude du rôle des phospholipases A2, notamment celle de type II, sécrétée par les macrophages alvéolaires, par l'endothélium vasculaire pulmonaire et par les plaquettes et son rôle dans l'inflammation pulmonaire.



Inflammation allergique. Mécanismes de l'éosinophilie allergique et de l'hyperréactivité bronchique.

(Marina Pretolani)

Suite à la bronchoconstriction et à l'oedème des voies aériennes induits par les allergènes, certains sujets asthmatiques développent une obstruction bronchique tardive et une hyperréactivité bronchopulmonaire à des stimuli non-spécifiques, associées à l'infiltration des voies aériennes par des éosinophiles et des lymphocytes T CD4+ activés. L'asthme est donc défini à présent comme étant un syndrome à caractère inflammatoire dans lequel les éosinophiles et les lymphocytes Th2 jouent un rôle délétère. Nous étudions les mécanismes impliqués dans le recrutement, l'activation et l'élimination des éosinophiles dans les voies aériennes en nous focalisant plus particulièrement sur le rôle de certaines cytokines. Pour ce faire, nous utilisons des modèles d'allergie des voies aériennes chez la souris immunisée et faisons appel à des cellules et tissus provenant de sujets normaux ou atteints d'asthme allergique. La provocation antigénique chez la souris sensibilisée induit un intense recrutement d'éosinophiles et de lymphocytes T CD4+ dans le liquide de lavage bronchoalvéolaire et la sous-muqueuse bronchique. Ces phénomènes s'accompagnent d'une hyperréactivité bronchique en réponse à des agents bronchoconstricteurs, comme l'acétylcholine ou la sérotonine, plus particulièrement chez des souris dites "Biozzi" BP2 (pour "Bons Producteurs" de la Sélection 2) dont la teneur sérique en IgE est très importante. Cette hyperréactivité est supprimée par les agents qui inhibent le recrutement des éosinophiles, par les glucocorticosteroïdes, par un anticorps dirigé contre l'IL-5, ou par des produits immunosuppresseurs. L'éosinophilie allergique est régulée principalement par des cytokines issues des lymphocytes T CD4+. Toutefois, certaines d'entre elles, comme l'IFN-gamma et l'IL-10, ont des propriétés anti-allergiques. Cette dernière, en particulier, inhibe plusieurs aspects de la réponse immunologique pulmonaire et péritonéale chez la souris sensibilisée. Plus récemment, nous avons montré que des souris déficientes en lymphocytes T gamma-delta immunisées et provoquées avec de l'ovalbumine présentent une inflammation pulmonaire allergique et une synthèse d'IgE très réduites comparées aux souris témoins. Ces réponses sont rétablies en administrant de l'IL-4 au cours de l'immunisation, ce qui suggère que les lymphocytes T gamma-delta favorisent la réponse Th2 chez la souris via la libération d'IL-4. Réduire l'infiltration ou l'activation des éosinophiles dans les voies aériennes, ou accélerer leur élimination, constituent des stratégies pour moduler l'asthme, ce qui nous a conduits à étudier les mécanismes de l'apoptose des éosinophiles humains. Nous avons montré la présence membranaire de Fas (APO-1, CD95) et celle, intracellulaire, de certains membres de la famille de Bcl-2 (Bcl-2, Bax, Mcl-1, Bcl-xL) ainsi que de la caspase-3 par des éosinophiles sanguins matures, ou immatures différenciés à partir de précurseurs du sang de cordons ombilicaux. Le profil de ces protéines diffère selon la maturité cellulaire et leur expression est une cible pour des cytokines qui prolongent la survie des éosinophiles, comme l'IL-5 et l'IFN-gamma, ou pour des agents qui, au contraire, induisent leur apoptose, comme les glucocorticostéroïdes. Finalement, nous avons rapporté une expression augmentée de Fas et de son ligand, Fas-L, au niveau de l'épithélium bronchique de sujets asthmatiques traités par des glucocorticostéroïdes. Nous suggérons que, sous l'action de ces médicaments, et via l'expression de ces antigènes, l'épithélium respiratoire pourrait acquérir un potentiel cytotoxique et réguler ainsi l'inflammation pulmonaire allergique.

Chronification de l'inflammation pulmonaire allergique et hyperréactivité bronchopulmonaire. Mécanisme de l'hyperréactivité bronchopulmonaire due à l'endotoxine bactérienne.

(B. Boris Vargaftig)

L'inflammation pulmonaire allergique est accompagnée par une hyperréactivité bronchopulmonaire, qui se manifeste après une seule provocation antigénique chez les souris BP2, caractérisées par des quantités considérables d'IgE dans le sang (voir ci-dessus). Un anticorps anti-IgE, administré avant la provocation antigénique, supprime cette hyperréactivité, ainsi que l'éosinophilie des voies aériennes et la production d'IL-4 qui l'accompagnent. Bien que la teneur sérique en IgE s'effondre rapidement, cela n'explique pas l'effet inhibiteur observé, puisqu'un effondrement identique a lieu si l'anticorps est administré avant la sensibilisation, sans que les effets de la provocation antigénique ne soient alors affectés. A ce stade, nous pensons que l'anticorps entre en compétition au niveau des récepteurs IgE, éventuellement situés sur les basophiles qui migrent aux voies aériennes avant même l'importante vague d'éosinophiles. Par ailleurs, dans ce même modèle, une intense métaplasie mucosale, également supprimée par l'anticorps anti-IgE, a été démontrée à partir de 48-72 heures après la provocation allergénique. L'hyperréactivité bronchopulmonaire n'est pas induite uniquement par les provocations allergéniques. Pour avancer vers des modèles fonctionnels d'origine infectieuse et vers le Syndrome de Détresse Respiratoire Aiguë (voir ci-dessous), nous avons entrepris une étude concernant les effets de l'endotoxine bactérienne (LPS). Son administration intra-nasale chez la souris C57BL/6 induit un intense recrutement de neutrophiles dans les poumons, la formation de TNF-alpha par les macrophages alvéolaires, une augmentation des résistances des voies aériennes et une hyperréactivité bronchopulmonaire. Simultanément, des produits de dégranulation des neutrophiles sont retrouvés dans les espaces aériens. Néanmoins, l'hyperréactivité bronchopulmonaire induite par le LPS ne semble pas dépendre directement du recrutement des neutrophiles. En effet, l'administration intra-péritonéale de LPS est suivie d'une hyperréactivité bronchopulmonaire non accompagnée par une inflammation pulmonaire évidente, même si cette hyperréactivité est inhibée par la dexaméthasone. L'implication possible du TNF-alpha en tant que cytokine produite par une cible péritonéale et agissant sur des cellules pulmonaires semble peu probable. Le rôle éventuel d'autres cytokines sera l'objet de recherches dans le futur immédiat.

Rôle de la phospholipase A2 sécrétée dans la physiopathologie pulmonaire.

(Lhousseine Touqui)

Nous avions montré précédemment que les macrophages alvéolaires de cobaye synthétisent et libèrent une phospholipase A2 sécrétoire (sPLA2) dont le clonage a révélé une homologie de séquence de 70 % avec la sPLA2 de type-II (sPLA2-II) humaine et de seulement 35 % avec la sPLA2 de type-I (sPLA2-I) du cobaye. L'expression de la sPLA2-II par les macrophages alvéolaires (MA) est régulée par la protéine kinase C (PKC). Ainsi, des inhibiteurs de la PKC suppriment la synthèse de la sPLA2-II. La protéine kinase A (PKA) joue, par contre, un rôle suppresseur dans la synthèse de cette enzyme. En effet, des agents qui augmentent le taux d'AMPc intracellulaire inhibent la synthèse de la sPLA2-II. Ce mode de régulation est différent de celui décrit pour d'autres types cellulaires dans lesquels la PKA joue un rôle inducteur dans la synthèse de la sPLA2-II. L'injection intra-trachéale du LPS chez le cobaye provoque des manifestations anatomo-cliniques similaires à celles observées au cours du SDRA chez l'homme. L'inflammation pulmonaire observée est accompagnée d'une forte expression de la sPLA2-II dans les tissus pulmonaires. L'hybridation in situ a montré que les MA étaient la principale source de la sPLA2-II synthétisée par les poumons. Cette synthèse, comme celle induite in vitro, n'est pas due à un effet direct du LPS mais est médiée, au moins en partie, par le TNF-alpha. En effet, l'expression de la sPLA2-II dans les poumons est précédée par une libération du TNF- alpha dans l'espace alvéolaire et est inhibée par des anticorps anti-TNF-alpha. Enfin, nous avons montré que la sPLA2-II libérée dans l'espace alvéolaire est impliquée dans l'hydrolyse des phospholipides du surfactant pulmonaire, phénomène fréquemment observé chez les patients souffrant de SDRA. Ainsi, l'inhibition de la synthèse ou de l'activité sPLA2 pourrait être envisagée comme une approche thérapeutique dans le traitement du SDRA chez l'homme.

Etude des voies de signalisation plaquettaire.

(Mohamed Hatmi)

L'activation plaquettaire met en jeu de nombreuses enzymes dont les plus importantes sont les PLA2 et C, la prostaglandine (PG) H synthétase, l'adénylate cyclase (AC) et les protéines kinases. Dans une récente étude, nous avons mis en évidence l'expression de l'ARNm codant pour la PLA2 sécrétée de type II (sPLA2-II) dans les plaquettes humaines et dans les cellules HEL, lignée aux caractéristiques mégacaryocytaires. Cette enzyme, présente de manière constitutive dans ces deux types cellulaires, est aussi exprimée par les mégacaryocytes humains. Son expression plaquettaire aux stades transcriptionnel et post-transcriptionnel est en faveur de son origine mégacaryocytaire. En outre, l'incubation des plaquettes avec la sPLA2-II recombinante humaine ne s'accompagne d'aucune endocytose, renforçant ainsi ce concept. L'enzyme libérée au cours de l'activation de ces cellules est en majeure partie adsorbée à la membrane plasmique, vraisemblablement sur des sites non-spécifiques. Nous avons, par ailleurs, démontré que la sPLA2-II et la Cox-2, deux enzymes fortement augmentées durant la réaction inflammatoire, sont exprimées de façon constitutive par les cellules endothéliales de la microcirculation pulmonaire humaine. Enfin, nous avons étudié le mécanisme du « cross-talk » décrit entre le récepteur du thromboxane (Tx) A2 et l'AC, enzyme générant l'AMPc à partir de l'ATP. En effet, le prétraitement des plaquettes par le U46619, un analogue de structure de PGH2, induit non seulement une désensibilisation du récepteur du TxA2 mais aussi la sensibilisation de l'AC. Nous avons, tout particulièrement, démontré que ce processus est étroitement dépendant de la voie de la PLC et indépendant de celle des protéines tyrosine kinases. La désensibilisation du récepteur du TxA2 est nécessaire mais non suffisante pour provoquer la sensibilisation de l'AC. En effet, cette interaction n'est pas inductible par d'autres agonistes et ne modifie pas l'activité de la guanylate cyclase. Par ailleurs, les réactions de phosphorylation/déphosphorylation semblent être impliquées dans ce phénomène puisque la phosphatase alcaline, enzyme déphosphorylante, bien qu'elle ne sensibilise pas directement l'AC, potentialise sa réponse à la prostacycline.

Interaction des neutrophiles avec les cellules de l'environnement vasculaire et aérien.

(Michel Chignard)

Les neutrophiles et les plaquettes interagissent in vivo dans plusieurs pathologies pulmonaires inflammatoires, notamment dans le SDRA. Nous avons montré que la stimulation des plaquettes par les neutrophiles in vitro s'expliquait par la libération de trois sérine-protéinases: la cathepsine G, l'élastase et la protéinase 3. Toutefois, seule la cathepsine G est capable d'activer directement les plaquettes. L'élastase, quant à elle, augmente la réponse à la cathepsine G, et ceci, sans faire intervenir les mécanismes de transduction intracellulaire. En fait, l'élastase exerce son effet au travers d'une activation de l'intégrine alphaIIbbeta3, un récepteur membranaire liant le fibrinogène et responsable de l'agrégation. Cette activation est la conséquence d'une protéolyse spécifique de la chaîne lourde de la sous-unité alphaIIb, ayant pour conséquence un changement de conformation de l'ensemble de l'intégrine. La cathepsine G et l'élastase agissent également sur les cellules endothéliales en inhibant spécifiquement leur activation par la thrombine. Le mécanisme sous-jacent est la conséquence d'une protéolyse du récepteur de la thrombine, puisque le domaine clivable par la thrombine et responsable de l'activation spécifique de ce récepteur disparaît après traitement par la cathepsine G et l'élastase. Une activité inhibitrice comparable est observée vis-à-vis de l'activation plaquettaire, en utilisant ces deux mêmes protéinases ainsi que la protéinase 3. A l'aide de peptides synthétiques et de la spectrométrie de masse, nous avons pu mettre en évidence plusieurs sites de clivage au sein du récepteur de la thrombine, variant selon les protéinases utilisées, et rendant compte des effets observés. La cathepsine G et l'élastase modifient également la réponse des monocytes au LPS, sous forme d'une inhibition de la synthèse du TNF-alpha. En fait, les protéinases, libérées par exocytose des neutrophiles activés, provoquent la disparition de l'expression d'un récepteur membranaire spécifique du LPS, le CD14. Cet effet semble être la conséquence d'une hydrolyse enzymatique de ce récepteur. Parallèlement, des travaux sont entrepris afin d'évaluer les effets de ces mêmes protéinases sur les cellules épithéliales pulmonaires concernant en particulier leurs capacité d'adhésion intercellulaire et d'adhérence à la matrice extracellulaire.