UNITÉ DE NEUROVIROLOGIE ET RÉGÉNÉRATION DU SYSTÈME NERVEUX

Responsable
DUBOIS-DALCQ Monique

e-mail : mdalcq@pasteur. fr


Bâtiment Darré/Département de Virologie
Institut Pasteur
25/28 Rue du Dr. Roux
75724 PARIS Cedex 15

Tél
01 4061 3420/01 4061 3422
Fax
01 4061 3421

Secrétariat

BALLET Saskya

Chercheurs permanents

BLONDEL Bruno
BRUZZONE Roberto
COLBERE-GARAPIN Florence
COUDERC Thérèse
GALELLI Anne, CNRS
LAFON Monique

Stagiaires de recherche

BOULADOUX Nicolas, DEA
CALAORA Viviane, Post-doc
CAMELO Serge, Thèse
D'ANDREA Paola, Dr en Sciences, Italie
DUNCAN Gillian, Thèse
FEIGENBAUM Valérie, Thèse
GIRARD Sophie, Thèse
LAZARINI Françoise, Post-doc
NICHOLSON Simone, Post-doc
PAVIO Nicole, Boursière Roux, Post-Doc
PETIT Isabelle, DEA
PEREA Javier, Maître de conférence, Universite de Paris VI
RESSOT Catherine, Thèse
ROGISTER Bernard, Dr en Médecine, Belgique
THOULOUZE Maria-Isabel, Thèse

Ingénieurs Techniciens Administratifs

CASANOVA Philippe, IP
DESCAMPS Ginette, IP
GOMES Danielle, IP
LAFAGE Mireille, IP
LE BLAY Hélène, IP
MURRAY Kerren, IP
PELLETIER Isabelle, IP
THAM To Nam, IP

Les thèmes de recherche de cette Unité créée en 1995 sont centrés dans les domaines de la neurovirologie alliée à la neuroimmunologie d'une part et la neurobiologie cellulaire et moléculaire d'autre part. Plus précisement, nous étudions (1) le neurotropisme du poliovirus et l'infection persistante par ce virus; (2) les superantigènes viraux dans la stimulation des réponses vaccinales et l'immunopathogenèse des maladies virales du système nerveux; (3) le rôle de la glycoprotéine du VIH dans la pathogenèse de l'infection du système nerveux observée dans le sida. En neurobiologie, nous étudions (1) l'origine et le développement des oligodendrocytes qui synthétisent la myéline dans le système nerveux central ainsi que leur régénération au cours des maladies démyélinisantes d'origine génétique, virale ou autoimmune; (2) la biologie moléculaire des connexines et l'analyse de leur rôle dans la physiopathologie de la maladie de Charcot-Marie-Tooth qui affecte les cellules de Schwann synthétisant la myéline du système nerveux périphérique. L'unité est organisée en 5 groupes de recherches.



L'infection Persistante du Poliovirus

(F. Colbère-Garapin)

Le poliovirus (PV) est un des virus humains les mieux caractérisés au niveau de sa structure, de son génome et de son mode de multiplication. Le PV peut établir une infection persistante dans des cellules humaines d'origine neuronale en culture (F. C.-G. et coll., PNAS 1989, 86, 7590), ce qui permet l'analyse des mécanismes moléculaires des interactions du PV avec ces cellules, et constitue un modèle in vitro pour étudier les propriétés de persistance des entérovirus en général, et du PV en particulier. Au cours de l'infection persistante des cellules neuronales humaines par le PV, des virus mutés, capables d'établir des infections persistantes dans des cellules non-neurales, sont sélectionnés. Nous avons identifié des déterminants viraux impliqués dans ce phénotype. Un seul déterminant est parfois suffisant pour conférer à un virus lytique la capacité d'établir des infections persistantes dans les cellules non-neurales HEp-2, mais l'association de plusieurs mutations a un effet synergique. Ces déterminants sont localisés en surface et à l'intérieur de la capside et modifient les interactions du virus avec son récepteur.

Physiopathologie de l'infection persistante du poliovirus dans le système nerveux central murin.

(B. Blondel et T.Couderc)

Les virus neurotropes en général, et les virus à ARN non rétroviraux en particulier, peuvent persister dans le système nerveux central (SNC) après la phase aiguë de l'infection et engendrer de nouvelles pathologies plusieurs mois, voire plusieurs années, après l'infection initiale. Les patients ayant développé une poliomyélite paralytique présentent, plusieurs décennies après la phase aiguë de la maladie, une nouvelle pathologie appelée syndrome post-polio et une infection persistante du poliovirus dans le SNC pourrait expliquer cette pathologie. Nous avons testé la capacité du poliovirus à persister dans le SNC murin grâce à des mutants dérivés de la souche PV-1/Mahoney qui présentent la particularité d'induire chez la souris une poliomyélite paralytique qui, comme chez l'homme, n'est pas systématiquement mortelle. La présence du poliovirus a été recherchée dans la moelle épinière de souris jusqu'à 12 mois post-paralysie. A tous les temps étudiés, les antigènes viraux et les particules virales ont été mis en évidence dans le cytoplasme des neurones moteurs de la moelle épinière après immuno-marquage (collaboration avec Josette Destombes et Danielle Thiesson, URA CNRS 1448, UFR Biomédical des Saints-Pères, Paris). L'ARN viral a également été détecté après réverse transcription et amplification par PCR. Ces résultats montrent que le poliovirus persiste dans le SNC des souris au moins jusqu'à 12 mois post-paralysie. Ce modèle nous permet d'étudier les mécanismes de l'infection persistante du poliovirus dans le SNC. Les résultats préliminaires indiquent que la multiplication du virus persistant est restreinte. Afin d'expliquer cette restriction, nous analysons le génotype et la réplication des virus persistants.

Infection des lymphocytes par le virus de la rage et apoptose

(M. Lafon)

Les souches atténuées et les souches neurovirulentes du virus de la rage présentent un tropisme cellulaire différent. Contrairement aux souches neurovirulentes comme CVS qui sont presque exclusivement neurotropes, les souches atténuées comme ERA infectent aussi des cellules non neuronales. Nous avons démontré que les deux souches de virus rabique ERA et CVS infectent in vitro les lymphocytes murins lorsqu'ils sont activés, ainsi que des cellules de lignée lymphoblastoïde T humaine (Jurkat). Dans les deux cas, les lymphocytes sont plus permissifs à la souche atténuée ERA qu'à CVS. Néanmoins, seule la réplication de ERA induit l'apoptose des cellules Jurkat infectées. L'apoptose a été mesurée par la technique TUNEL, par analyse de la fragmentation de la chromatine, en microscopie électronique et par électrophorèse. La glycoprotéine virale (G) semble jouer un rôle important dans l'induction de la mort cellulaire programmée, puisque ce processus débute parallèlement à la synthèse de la protéine G. Nos résultats indiquent que : 1) le virus de la rage infecte les lymphocytes 2) l'infection des lymphocytes par la souche rabique atténuée provoque l'apoptose de ces cellules 3) ce processus n'inhibe pas la production virale par les cellules infectées. De plus, contrairement à la souche CVS neurotrope, le virus ERA et d'autres souches atténuées vaccinales provoquent une forte réponse immunitaire et constituent ainsi des vaccins vivants efficaces. Le fait paradoxal qu'un virus induise une forte réponse immunitaire bien qu'il infecte des lymphocytes et induise leur apoptose, suggère que l'apoptose des lymphocytes infectés par le virus de la rage puisse avoir un rôle favorisant la réponse immunitaire anti-virale. Il pourrait être proposé que la production de corps apoptotiques contenant des antigènes viraux favorise la présentation de ces antigènes. L'apoptose viro-induite dans une fraction de lymphocytes ne serait donc pas un phénomène qui favorise l'immunosuppression, mais serait en fait un mécanisme immunopotentiateur.

Le superantigène rabique est un adjuvant de la réponse vaccinale mucosale

(M . Lafon)

Pour étudier l'influence du superantigène sur une réponse immune associée, une vaccination grippe, nous avons développé les années précédentes un modèle in vivo constitué de deux lignées congéniques de souris, l'une, les BALB/c exprimant les cellules T cibles du superantigène, les Vb6, l'autre, les BALB.D2, qui en sont dépourvues et qui par conséquent ne répondent pas au superantigène rabique. Nous avions trouvé précédemment que l'injection concomitante de NC et de vaccin, par la voie intra-péritonéale, augmentait significativement et très précocement la réponse anticorps protectrice. La NC augmentait aussi la réponse proliférative des lymphocytes leur production d'IL-2 et d' IL-4 et augmentait la fréquence des lymphocytes Vb6 spécifiques de l'antigène vaccinal. En revanche, aucun effet adjuvant n'était observé chez les BALB.D2. L'ensemble de ces résultats nous a permis de proposer qu'en stimulant les TVb6, le superantigène de la rage était capable d'amplifier la réponse antigénique associée et qu'il pouvait donc constituer une nouvelle classe d'adjuvant (Astoul et al, 1996). Cette année, nous avons poursuivi l'étude des propriétés adjuvantes de la NC en utilisant un modèle de vaccination mucosale L'instillation conjointe de vaccin et de NC, induit une augmentation des anticorps spécifiques du vaccin. Nous avons montré par la technique d'Elisaspot que cette augmentation d'anticorps sériques spécifiques s'accompagne dans les glandes sous maxillaires et ganglions du cou ainsi que dans les poumons d'une élévation du nombre de cellules B productrices d'immunoglobulines d'IgG, IgA et de cellules productrices de cytokines (IFN-g et IL-6 et IL-4). Nous avons comparé les propriétés du superantigène de la rage à celle du superantigène du Mycoplasme (MAM) et à celles du superantigène bactérien SEB en ce qui concerne leur aptitude à adjuver une réponse vaccinale mucosale. Nos expériences chez la souris permettent d'établir que seuls les superantigènes issus du virus de la rage ou du mycoplasme sont doués de propriétés immunopotentiatrices (Astoul et al, article en préparation).

Perturbations immunologiques du système nerveux infecté par le virus de la rage

(M. Lafon)

Nous avons poursuivi la description des réponses immunes locales et systémiques de l'infection rabique. Cette année, nous avons ainsi étudié les cinétiques d'apparition des cytokines (IFN-g, IL-6, TNF-a) dans le cerveau de souris développant soit une encéphalite soit une rage paralytique. Nous avons aussi étudié la nature des cellules immunes (T, B, CD4, CD8, macrophages) présentes dans le cerveau au cours de ces deux types d'infection soit par cytofluorimétrie soit par immunohistochimie sur coupes de moelles épinières et de cerveaux infectés.(Galelli et al, article soumis, Camelo et al, article en préparation). Sachant que le système nerveux est un territoire immunologiquement privilégié qui dispose d'un système Fas-Fas ligand permettant théoriquement l'élimination par apoptose des lymphocytes potentiellement dangereux pour la pérennité des fonctions nerveuses, nous avons recherché la présence d'apoptose dans le système nerveux des souris immunocompétentes au cours de l'infection rabique. Nos résultats indiquent clairement que les broyâts de cerveaux ou de moelles épinières des animaux infectés par le virus de la rage contiennent des noyaux cellulaires qui subissent le processus d'apoptose. Nous cherchons à savoir maintenant en utilisant une technique de double marquage TUNEL - marqueur cellulaire (CD4, CD8, F480, B220, antigènes rabiques) si cette apoptose qui corrèle avec le degré d'infection correspond à des lymphocytes ou à des neurones infectés.

Développement et régénération des cellules synthétisant la myéline du système nerveux central (SNC)

(M. Dubois-Dalcq)

La myéline permet la conduction rapide des influx nerveux le long des faisceaux axonaux et est essentielle à la plupart des fonctions motrices, sensorielles et intégratrices du système nerveux. Cette membrane multilamellaire est synthétisée par les oligodendrocytes dans le système nerveux central. Nous étudions comment les oligodendrocytes sont engendrés à partir des cellules souches du système nerveux central chez les rongeurs et l'homme. Nous propageons les cellules souches neurales du cerveau: ces cellules forment des neurosphères et sont multipotentielles, pouvant engendrer des astrocytes, neurones et oligodendrocytes. Nous investiguons la nature des signaux qui induisent le destin oligodendrocytaire dans ces cellules souches en particulier le rôle de l'hormone thyroidienne et des neuregulines. Dans le cerveau de rat nouveau-né, nous avons caractérisé un precurseur glial bipotential qui porte la molécule NCAM polysialylée sur sa surface et a une potentialité plus restreinte que les cellules souches neurales puisque ce précurseur engendre seulement les lignées oligodendrocytaire et astrocytaire. Notre intéret se porte aussi sur la pathogenèse de la leukodystrophie adrénale, une maladie demyelinisante d'origine génétique souvent mortelle chez les garçons et causée par une mutation du gène codant pour une protéine peroxisomale (ALDP, collaboration avec Dr P. Aubourg, INSERM U342, St Vincent de Paul). Cette protéine qui permet le transport des acides gras à longue chaîne dans les peroxisomes est exprimée dans les astrocytes et la microglie ainsi que dans certaines sous-populations d'oligodendrocytes in vivo. Nous utilisons un vecteur retroviral pour transférer le gène humain normal dans les cellules synthétisant la myéline et portant la mutation de façon à pouvoir corriger l'accumulation des acides gras observée chez les patients et l'instabilité de la myéline qui peut en découler.Nous investiguons cette question chez des souris dont le gène ALD a été inactivé par recombinaison homologue (collaboration avec le groupe du Dr K. Nave, Heidelberg).

Mécanismes de neurotoxicité de la glycoprotéine du VIH

(M. Dubois-Dalcq)

Le VIH infecte rarement les cellules dérivées du neuroectoderme tout en causant indirectement des dysfonctions et/ou mort des cellules nerveuses conduisant à des altérations neurologiques très prononcées. La gp160 du VIH exprimée dans les cellules microgliales humaines est clivée en gp120 et gp41 et la gp120 est relachée dans le milieu extracellulaire. La gp120 pourrait alors s'attacher à d'autres cellules nerveuses et éventuellement signaler la mort apoptotique des neurones, observée dans le cerveau de patients infectés. Nous étudions les effets de la glycoproteine virale des souches VIH tropiques pour les cellules T ou cellules macrophagiques (dénommées X4 et R5) sur les neurones de rat hippocampaux en culture et sur les cellules PC12, une lignée neuronale qui peut être induite à se différencier par le « Nerve Growth factor ». En utilisant le FACS et des inhibiteurs spécifiques, nous avons identifié un récepteur neuronal auquel la glycoproteine du VIH peut s'attacher en l'absence de CD4 (collaboration avec le groupe de JL Virelizier).

Communication entre cellules par les canaux intercellulaires

(R. Bruzzone)

L'activité de recherche du laboratoire est consacrée à l'étude de la communication entre cellules par les canaux intercellulaires. Ces canaux sont formés par l'oligomérisation des connexines, une famille multigénique de protéines dont nous analysons les caractéristiques biologiques et physiologiques avec des techniques de biologie cellulaire, moléculaire et d'électrophysiologie. Des associations entre connexines mutées et pathologie humaine ont été mises en évidence. Il a été démontré qu'une forme de la maladie de Charcot-Marie-Tooth, celle liée au chromosome X (CMTX), est associée à des mutations du gène codant pour la connexine32 (Cx32) et que Cx26 est responsable de la forme la plus fréquente de surdité non-syndromique (DFNB1). La maladie de CMT est une neuropathie motrice et sensorielle et dans la vaste majorité de cas, il s'agit d'une affection des cellule de Schwann, entraînant une démyélinisation progressive du système nerveux périphérique (SNP). La Cx32 est exprimée dans la région paranodale et les incisures de Schmidt-Lanterman de la myéline du nerf périphérique, une localisation qui n'est pas compatible avec la formation de canaux intercellulaires entre cellules de Schwann adjacentes, mais suggère, en revanche, la formation de canaux intracellulaires entre les différentes couches de myéline. Notre hypothèse est que la Cx32 permettrait la formation d'une voie préférentielle pour l'échange de messagers et métabolites entre les régions peri-nucléaire et peri-axonale d'une cellule de Schwann. Nous avons démontré que certaines mutations entraînent une perte totale de la capacité de former des canaux fonctionnels tandis que d'autres sont capable d'induire des courants macroscopiques comme la Cx32 sauvage. Nous envisageons d'exploiter cette différence pour caractériser le défaut moléculaire responsable du CMTX. Dans le but d'élucider le rôle spécifique de la Cx32 dans la myéline du SNP, nous avons établi des cultures purifiées de cellules de Schwann de souris. L'objectif à long terme est de développer un système de myélinisation in vitro pour définir les mécanismes moléculaires à travers les quels Cx32 assure le maintien de l'intégrité de la gaine myélinique. Plus récemment, il a été démontré que la forme plus la fréquente de surdité non-syndromique est associée à des mutations du gène codant pour la Cx26. Notre objectif est de comprendre les conséquences fonctionnelles de ces mutations et d'utiliser cette étude pour développer, en collaboration avec l'Unité de Génétique des Déficits Sensoriels dirigée par Christine Petit, un modèle animal approprié.



In the field of neurovirology, we study how Poliovirus (PV) establishes persistent infections in vitro and in vivo. Mutants viruses have been selected in vitro that are able to persistently infect non-neural cells. A single determinant can confer a persistent phenotype to a lytic strain in HEp-2 cells, but the presence of several mutations have a synergistic effect. These determinants are localized on the surface and inside the capsid, influencing interactions of the virus with its receptor. A mouse adapted poliovirus can cause paralytic poliomyelitis and persist in the central nervous system (CNS). The molecular and cellular mechanisms of this persistent infection and its possible effects on the host are being studied in vivo. In rabies infection, attenuated strains of rabies virus can infect lymphocytes and cause their apoptosis. This may result in superantigen release that has important adjuvant properties in the course of vaccination. When rabies virus superantigen accumulates in the nervous system, immune cells invade the brain and cytokines are produced in mice whose lymphocytes bear Vb6 compared to mice that lack these appropriate target T cells. HIV-1 infection of the CNS may lead to severe cognitive impairment and neuronal loss although HIV replicates mostly in brain macrophages and not in neurons. Rat PC12 neuronal cells express CXCR4 transcripts and bear this seven transmembrane G-coupled protein on their surface before and after differentiation. We are studying whether the natural ligand of CXC-R4 and the HIV glycoprotein signal this chemokine receptor and influence neuronal function. In the field of neuroscience, we have characterized a new type of early precursors of oligodendrocytes, the myelin-forming cells of the CNS, in the neonatal rat brain. These precursors express PSA-NCAM at their surface and are restricted to a mostly glial fate, generating astrocytes and oligodendrocytes. To study mechanisms by which multipotential neural stem cells give rise to oligodendrocytes, we use an in vitro system that mimicks proliferation, migration and differentiation of neural precursors from the periventricular zone. The specific role of connexins, the molecular constituents of intercellular channels, has been highlighted by the demonstration that two genetic diseases are linked to mutations of connexin genes. Thus, patients with the X-linked form of Charcot-Marie-Tooth disease, a peripheral neuropathy, have mutations in the gene encoding connexin32 (Cx32), while Cx26 mutations are found in hereditary non-syndromic deafness (DFNB1). We characterize the functional consequences of connexin mutations in order to develop appropriate in vitro and in vivo models that will allow to understand the pathophysiology of these two disorders.