LABORATOIRE DE CHIMIE STRUCTURALE DES MACROMOLECULES

Responsable
BARZU Octavian

e-mail : obarzu@pasteur.fr


CNRS URA 1129

Département de Biochimie et Génétique Moléculaire
Institut Pasteur
28 Rue du Dr. Roux
75724 PARIS Cedex 15

Tél
01 4568 8405
Fax
01 4568 8405

Secrétariat

FERRAND Mireille, IP

Chercheurs permanents

GILLES Anne-Marie, IP
MUNIER-LEHMANN Hélène, INSERM

Stagiaires de recherche

BUCURENCI Nadia, Post-doc
GALLAY Inès, Post-doc
LANDAIS Stéphanie, Thèse
PAUN Irina, Post-doc
PERRIER Véronique, Thèse
TOURNEUX Lise, Thèse

Ingénieurs Techniciens Administratifs

LAURENT-WINTER Christine, IP
NAMANE Abdelkader, IP
SAKAMOTO Hiroshi, IP

Le laboratoire de Chimie Structurale des Macromolécules étudie les nucléoside monophosphate (NMP) kinases bactériennes pour s'orienter dans la conception de nouveaux agents antibactériens. Cette démarche s'inspire du rôle essentiel de ces enzymes dans le métabolisme bactérien et des différences de structure primaire ou quaternaire des enzymes similaires chez les eucaryotes. Parmi les résultats les plus importants, obtenus au cours de l'année 1997, nous mentionnerons : a) l'analyse complète de la CMP-kinase de Escherichia coli par diffraction aux rayons X; b) l'isolement et la caractérisation de l'adényl kinase de Yersinia pestis et de Mycobacterium tuberculosis; c) l'isolement et la caractérisation de la TMP-kinase de Y. pestis et M. tuberculosis ainsi que de mutants de l'enzyme de E. coli rendant la bactérie sensible aux analogues de nucléotides; d) la caractérisation immunochimique de l'UMP kinase de E. coli et la localisation par immunomicroscopie électronique de trois NMP kinases de E. coli.



Sans titre

(Responsable non identifié)

Plusieurs approches ont été utilisées afin de caractériser les NMP kinases de E. coli et de deux autres organismes pathogènes, Y. pestis et M. tuberculosis : a) analyse structurale en solution (RMN, dichroïsme circulaire, fluorescence) ou cristallographie; b) interaction avec les anticorps mono- ou polyclonaux; c) mutagenèse dirigée et modification chimique; d) spectrométrie de masse des formes sauvage ou modifiées.

L'adényl kinase (AK) de Yersinia pestis et de Mycobacterium tuberculosis

(Hélène Munier-Lehmann)

La diversité structurale des adényl kinases (AKs) bactériennes s'est de nouveau confirmée par l'analyse de l'enzyme de ces deux organismes pathogènes. Tandis que l'AK de Y. pestis est une forme "longue" (214 acides aminés) comme la plupart des formes bactériennes ou mitochondriales ayant une homologie de séquence de 88% par rapport à son correspondant chez E. coli, l'AK de M. tuberculosis est une forme "courte" (181 acides aminés) ayant 30% d'homologie avec l'enzyme cytosolique des mammifères. Plusieurs mutants d'AK de Y. pestis ont été obtenus afin de créer des souches "atténuées" de Y. pestis aux propriétés vaccinales. Deux mutations (Pro87Ser et Ser129Phe) ont rendu l'AK instable avec une solubilité restreinte et une capacité catalytique diminuée de manière significative par rapport à l'enzyme sauvage. L'adényl kinase de M. tuberculosis, outre sa taille (elle est la plus petite AK connue à ce jour) est dotée d'une stabilité thermique remarquable, confirmée aussi par un échange H ð D extrêmement lent. Cette flexibilité structurale réduite est accompagnée d'une diminution de son pouvoir catalytique par rapport à l'enzyme de E. coli (collaboration avec les Unités de Bactériologie Moléculaire et Médicale et Génétique Moléculaire Bactérienne, IP).

La CMP kinase (CMPK) de Escherichia coli

(Anne-Marie Gilles)

L'enzyme ayant 225 acides aminés a peu d'homologie avec les CMPKs d'origine eucaryote même si l'alignement de séquence suggère que les résidus impliqués dans la fixation du substrat ou dans la catalyse sont conservés. Ces observations sont largement confirmées par la structure de la CMPK de E. coli à une résolution de 1.8 Å. Le c¦ur de la protéine est constitué de cinq brins b parallèles entourés par huit hélices a. Un segment de 36 acides aminés sans aucun équivalent chez les NMP kinases connues est constitué de deux brins b anti-parallèles et une hélice a. L'analyse de la CMPK en présence de ses substrats est en cours. Les changements de conformation induits par l'interaction protéine-ligands nous procureront peut-être des informations sur le rôle de ce segment de 36 acides aminés dans la "fermeture" du site actif (collaboration avec P. Briozzo, Laboratoire de Biologie Structurale, UMR-9920 du CNRS).

La TMP kinase (TMPK) de Yersinia pestis et de Mycobacterium tuberculosis

(Anne-Marie Gilles)

Les TMPK représentent environ 0.01% des protéines bactériennes. Ce faible pourcentage ainsi qu'une activité spécifique de seulement 5 à 10 % de celle des AKs font des TMPKs des cibles idéales pour la thérapie antibactérienne. Après avoir précédemment caractérisé l'enzyme de E. coli, Haemophilus influenzae et Bacillus subtilis, nous avons exploré les particularités des enzymes homologues chez Y. pestis et M. tuberculosis. Les TMPKs ont en général un faible degré d'homologie. L'alignement de séquence des sept enzymes bactériens révèle seulement 9% des résidus conservés. Riches en structure secondaire en hélice a, les TMPKs de ces deux bactéries pathogènes sont des dimères relativement stables, dissociés par des agents chimiques comme l'urée ou la guanidine. La TMPK de M. tuberculosis, comme l'AK de la même bactérie, est plus résistante à la dénaturation que les autres formes étudiées. D'autre part, sa spécificité de substrat est plus restreinte que celle de E. coli ou de Y. pestis (collaboration avec les Unités de Bactériologie Moléculaire Médicale et Génétique Moléculaire Bactérienne, IP).

Analyse immunochimique de l'UMP kinase (UMPK) de Escherichia coli

(Stéphanie Landais)

Les UMPKs bactériennes n'ont pas d'équivalent chez les organismes eucaryotes. Vu leur rôle important dans la division cellulaire, ces enzymes représentent aussi des cibles idéales pour les drogues antibactériennes. D'autre part, leur structure hexamérique et la régulation de leur activité par les nucléotides GTP et UTP nécessitent une connaissance approfondie de la structure quaternaire. Comme les anticorps polyclonaux dirigés contre l'UMPK de E. coli inhibent l'activité enzymatique et annulent l'effet activateur du GTP sans pour autant avoir d'effet sur l'action inhibitrice de l'UTP, nous avons utilisé plusieurs anticorps monoclonaux obtenus chez la souris. Un de ces anticorps (issu d'un fragment d'UMPK) reconnaît la protéine intacte, l'épitope étant situé entre les résidus 120 et 180. Une localisation plus fine de l'épitope reconnu est envisagée à l'aide de la spectrométrie de masse. Les anticorps polyclonaux ont servi ensuite à localiser l'UMPK chez E. coli. Environ les deux-tiers de l'UMPK sont localisés à la périphérie de la cellule, le tiers restant est cytosolique. Cette distribution particulière qui résulte des propriétés d'autoagrégation de l'UMPK semble liée à une deuxième fonction de l'enzyme, différente de sa fonction catalytique (collaboration avec le Laboratoire d'Hybridolab et la Station Centrale de Microscopie Electronique, IP).

Autres activités

(Responsable non identifié)

Dans le courant de l'année 1997, deux activités ont été développées dans le laboratoire : la spectrométrie de masse et l'électrophorèse bidimensionnelle. Elles permettront une meilleure valorisation des efforts de la communauté pasteurienne dans l'étude de l'expression des gènes dans des conditions physiologiques et pathologiques particulières.



The Laboratory of Structural Chemistry of Macromolecules investigates the nucleoside monophosphate (NMP) kinases from bacteria which might represent targets for new drugs. Some of these enzymes have different primary or quaternary structures as compared to their counterparts in eukaryotes. We underline some of the most significant results obtained in 1997 : a) the complete 3D structure of CMP kinase from E. coli by X-ray analysis of protein crystals; b) purification and biochemical characterization of adenylate kinase from Yersinia pestis and Mycobacterium tuberculosis; c) purification and characterization of TMP-kinase from Y. pestis and M. tuberculosis as well as of mutants from the enzyme of E. coli capable of inducing an increased sensitivity of the bacterium towards nucleoside analogs; d) immunochemical characterization of UMP kinase from E. coli and cellular distribution of three NMP kinases by immunoelectron microscopy.