UNITÉ D'IMMUNO-HÉMATOLOGIE ET D'IMMUNOPATHOLOGIE

Responsable
DIGHIERO Guillaume

e-mail : dighiero@pasteur.fr


Département de Physiopathologie
Bâtiment Emile Roux
Institut Pasteur
25/28 Rue du Dr. Roux
75724 PARIS Cedex 15

Tél
01 4568 8210
Fax
01 4568 8951

Secrétariat

BOUYSSIÉ Reine, IP

Chercheurs permanents

POURCEL Christine, IP
SCOTT-ALGARA Daniel, IP

Stagiaires de recherche

CAYOTA Alfonso, Post-doc
DIAW Lena, Thèse
HAVOUIS Séverine, DEA
MALOUM Karim, Post-doc
PRITSCH Otto, Thèse

Ingénieurs Techniciens Administratifs

VUILLIER Françoise, IP
DUMAS Gérard, IP
MAGNAC Christian, IP

Résumé

(Responsable non identifié)

Le travail de l'Unité d'Immuno-hématologie et Immunopathologie a été consacré à l'étude: I) Des Autoanticorps naturels (AAN) et l'autoimmunité; II) La leucémie lymphoïde chronique (LLC) et la pathologie maligne du lymphocyte B, et III) L'Immunopathologie du SIDA. Dans le domaine des autoanticorps naturels le travail a porté sur la création d'un modèle transgénique de la maladie des agglutinines froides humaines, à l'étude des bases structurales de la polyréactivité des autoanticorps naturels et à l'étude dans un modèle particulier du rôle de l'isotype dans l'affinité des anticorps. Dans le but de mieux définir le rôle du récepteur B pour l'antigène dans le processus de leucémogénèse, nous avons entrepris l'étude de ce récepteur dans 18 familles distinctes de LLC comportant chacune au moins deux membres atteints de la maladie. Dans le domaine du SIDA nous nous sommes attachés à l'étude de la reconstitution immunologique chez des malades au stade de porteur asymptomatique traités par trithérapie antivirale.

Autoanticorps naturels et autoimmunite

(Responsable non identifié)

Antécédents En 1981 avec B. Guilbert et S. Avrameas, nous avons pu démontrer l'existence fréquente dans le sérum humain normal d'autoanticorps naturels polyréactifs. Par la suite, nous avons pu démontrer, que les précurseurs de ces AAN existaient avec une fréquence très importante dans le répertoire B normal (1983) et qu'ils étaient présents très tôt pendant l'ontogénie (1985). Cette notion a été définitivement établie par nous (1986) et d'autres groupes en démontrant que ces anticorps sont une composante très importante du répertoire germinal, puisqu'ils apparaissent tôt dans l'ontogénie, expriment des idiotopes récurrents et des gènes en configuration germinale. Ces travaux montrent clairement que l'autoimmunisation est un phénomène physiologique. Si ces autoanticorps sont toujours dirigés contre des composants du soi, ce qui autorise à les appeler autoanticorps, ils ne sont toutefois pas spécifiques de l'individu, puisqu'ils reconnaissent des déterminants publics, présents chez tous les individus d'une même espèce, et parfois comme c'est le cas des autoanticorps anti-ADN et anti-récepteur de l'acethylcholine, communs à des espèces différentes. Cette dernière caractéristique est par ailleurs partagée par les autoanticorps pathologiques. Le deuxième élément nouveau, fut la démonstration que ces autoanticorps naturels sont capables de reconnaitre à la fois plusieurs antigènes aussi éloignés que le DNA, les protéines du cytosquelette et des antigènes phospholipidiques (1983 et 1988). Cette notion, qui a été très controversée lors de notre description initiale (1982 et 1983) est à présent établie. Le mécanisme par lequel ces anticorps sont capables de réagir simultanément avec des antigènes très différents reste cependant à établir. Si le rôle physiologique de ces AAN reste à définir, il est très probable que ces AAN constituent une composante essentielle de l'immunité naturelle et qu'ils jouent un rôle majeur comme première barrière de défense. Reste à définir si ce répertoire, pourrait constituer un répertoire précurseur des anticorps immuns et des autoanticorps pathologiques. Pendant cette année, nos travaux sur ce sujet ont été consacrés à: 1) La création d'un modèle de souris transgénique d'anémie hémolytique autoimmune; 2) Mieux définir les corrélations entre la structure et l'affinité des AAN polyréactifs; 3) Etudier dans un cas précis, la capacité de la partie CH1 de 2 anticorps de moduler les interactions antigène-anticorps. Projets de recherche 1) Création d'un modèle de souris transgénique d'anémie hémolytique autoimmune. (Christine Pourcel) La maladie des agglutinines froides (AF), est caractérisée par la production d'autoanticorps froids dirigés contre des déterminants glycolipidiques du globule rouge, qui donnent lieu à une anémie hémolytique autoimmune (AHAI). Nous avons étudié au niveau moléculaire une agglutinine froide (CAGAS) qui avait la particularité d'agglutiner les globules rouges de souris avec une meilleure affinité que les globules rouges humains et de les hémolyser en présence de complément, ce qui fait d'elle un candidat de choix pour créer un modèle expérimental murin. Après avoir introduit dans des vecteurs d'expression eucaryotes les fragments d'ADN contenant tous les élements nécessaires à l'expression de CAGAS, ils ont été transfectés par électroporation dans le myélome de souris non-sécrétant X-63 et les clones exprimant CAGAS ont été sélectionnés. Deux groupes de souris normales BALB/c ont été injectées soit avec l'IgMGAS soit avec des cellules transfectées par voie i.p. Les deux groupes ont développé une maladie des AF. Ces résultats montrent pour la première fois la possibilité de créer un modèle murin de la maladie des AF humaine. Des souris transgéniques ayant intégré la CAGAS ont été construites. Les premiers résultats montrent que ces souris sont capables de produire des niveaux importants sériques de la CAGAS. Mis à part la création du premier modèle animal de cette maladie, ces souris constituent le premier modèle d'étude de la tolérance aux glycolipides et pourraient constituer un modèle priviligiée pour l'étude des vaccins anti-idiotypiques. 2) Corrélations entre la structure et l'affinité des AAN polyréactifs. (Guillaume Dighiero) Les autoanticorps naturels (AAN) sont capables de reconnaitre à la fois plusieurs antigènes aussi éloignés que l'ADN, les protéines du cytosquelette et des antigènes phospholipidiques, mais les bases structurales de cette polyréactivité restent à définir. En utilisant le BIAcore, nous avons montré que certains de ces anticorps polyréactifs reconnaissent différents antigènes à la fois avec des affinités allant de 10-6 à 10-8, qui correspondent à des affinités fréquemment retrouvées dans les anticorps immuns. Les études structurelles ménées en parallèle n'ont pas permis de retrouver des corrélats structurels à cette polyréactivité. Toutefois, des études cristallographiques récentes, montrent l'absence de corrélats structurels qui puissent expliquer la réactivté croisée de certains anticorps contre différents antigènes. L'adaptabilité moléculaire de surface qui est un principe général à la base de la promiscuité des interactions protéine-protéine pourrait jouer un rôle important dans la polyréactivité des anticorps naturels. 3) Etude dans un cas précis, de la capacité de la partie CH1 de 2 anticorps de moduler les interactions antigène-anticorps. (Guillaume Dighiero) Bien que le processus de commutation isotypique s'accompagne fréquemment d'une maturation dans l'affinité de l'anticorps, celle-ci est essentiellement le produit de mutations somatiques intervenant dans les parties hypervariables et il est généralement admis que les parties constantes des chaînes lourdes ne jouent pas un rôle dans le déterminisme de l'affinité d'un anticorps. Nous avons étudié au niveau moléculaire 2 protéines monoclonales (IgA1 et IgG1) exprimant une activité autoanticorps anti-tubuline, présentes dans le sérum d'un malade atteint d'une gammapathie monoclonale multiple. La séquence protidique complète des chaînes lourdes et légères de l'IgA1 et de l'IgG1, était identique au niveau des domaines variables. A partir du cDNA des lymphocytes B du malade la séquence nucléotidique de l'IgA a été établie, et à partir des lymphocytes T du même malade ses contreparties germinales non réarrangées ont été obtenues. L'affinité pour la tubuline de l'IgA1 et de l'IgG1, déterminée par BIAcore et par ELISA, a montré une différence très significative de l'ordre de 30 fois (2,85 x 10-8 M pour l'IgA1 et 1,02 x 10-6 M pour l'IgG1). Des résultats comparables ont été trouvés en déterminant l'affinité avec des fragments F(ab')2 et Fab. Cette différence dans l'affinité de ces deux Ig était donnée par une différence très importante dans la constante cinétique d'association. Ces résultats obligent à discuter la possibilité que le domaine CH1 de la région constante, en changeant la conformation de la molécule, puisse jouer un rôle dans la liaison avec l'antigène. Pour mieux démontrer ce phénomène et pour pouvoir l'étudier sur le plan tridimensionnel nous construisons des vecteurs contenant la partie variable de l'IgA1 associé la partie constante de l'IgG1 et de l'IgM, qui devraient nous permettre d'obtenir des quantités importantes de chaque isotype. De plus, nous avons caractérisé l'épitope reconnu sur la tubuline par ces anticorps.

La leucemie lymphoide chronique (llc) et la pathologie maligne du lymphocyte b

(Responsable non identifié)

Antécédents 1) Etudes pronostiques et thérapeutiques dans la LLC. Avec Jacques-Louis Binet nous avons décrit une classification pronostique de cette maladie qui a permis de séparer les malades en trois groupes pronostiques et qui a été adoptée comme la classification internationale de référence. Depuis 1976, avec Jacques-Louis Binet, Claude Chastang et Philippe Travade, nous avons constitué le Groupe Français Coopératif pour l'étude de la Leucémie Lymphoïde Chronique. Ce groupe comprend plus de 80 services français et a réussi à inclure plus de 3000 malades dans des protocoles thérapeutiques. L'étude de trois protocoles randomisés nous a permis de montrer que: 1) Les malades appartenant au groupe de bon pronostic ne devraient pas recevoir de traitement dans un premier abord, puisque ces malades ont une survie proche de celle d'une population normale du même sexe et du même âge. Fait important, ce groupe comprend deux tiers des malades atteints par cette maladie (1990). 2) Dans les formes graves de la maladie nous avons démontré l'intérêt d'une association polychimiothérapique (CHOP) et d'un analogue des purines, la Fludarabine. 2) Etudes biologiques a) Le lymphocyte B qui prolifère dans la LLC exprime d'une façon caractéristique de faibles taux d'immunoglobulines de membrane. Depuis 1972, nous nous intéressons à la biologie du lymphocyte B qui prolifère dans la LLC. Nous avons montré que le lymphocyte B de la LLC, exprime une quantité très faible d'immunoglobulines de membrane (1974, 1976, 1980). Cette anomalie, qui associée à des défauts fonctionnels de ce lymphocyte ont conduit à postuler que le lymphocyte B qui prolifère dans cette maladie est une cellule B « anergique », est encore de nos jours considérée comme le meilleur marqueur diagnostic de cette maladie. b) La pathologie maligne du lymphocyte B implique fréquemment le répertoire producteur des AAN. Dans trois modèles différents (LLC, lymphomes folliculaires et protéines monoclonales) nous avons pu démontrer que le répertoire qui produit les AAN, est fréquemment la cible des processus de transformation maligne du lymphocyte B. Comme ce répertoire, du fait de son autoréactivité est constamment sollicité, nous avons postulé que cet état d'activation permanente, pourrait créer les conditions propices à la survenue d'un événement oncogénique. En collaboration avec Michel Potter du NIH, nous avons étudié l'activité anticorps de 33 myélomes induits par l'injection intra-péritonéale de silicone. Neuf parmi ces 33 myélomes présentaient une activité AAN. Cette fréquence est proche de celle que nous avions rétrouvée dans les protéines monoclonales humaines. De plus, sur 6 clones indépendants que nous avons étudié sur le plan structural, 4 partageaient le même réarrangement et la même séquence VH et VL. Ces résultats indiquent que ces myélomes dérivent fréquemment d'un précurseur B spécifique, engagé dans la production d'une activité AAN et qui exprime une gamme restreinte de gènes VH. c) Etude de l'expression des gènes VH dans la pathologie maligne du lymphocyte B. Nous avons entrepris d'étudier l'expression des gènes V dans la pathologie maligne du lymphocyte B. Nous avons étudié cette expression surtout dans les hémopathies lymphoïdes chroniques (LLC, Léucémie Prolymphocytaire et Léucémie à Tricholeucocytes). De ces études il ressort que l'expression des gènes VH ne se fait pas en suivant un processus aléatoire et qu'il existe un certain nombre de gènes surexprimés lors des différentes pathologies malignes du lymphocyte B. Les raisons de la surexpression de certains gènes ne sont pas connues à ce jour. Projets de recherche Etude dans des cas familiaux de LLC du rôle du récepteur de l'antigène dans le processus de leucémogénèse. (Béatrice Brogard) Pour mieux définir le rôle du récepteur pour l'antigène, nous étudions 18 familles ayant au moins deux membres atteints par une LLC. Cette recherche porte sur l'étude de l'activité anticorps des Ig exprimées par le clone tumoral, ainsi que l'étude des gènes VH et VL exprimés et l'étude de la chaîne Igb du récepteur B, qui est sous-exprimée et présente de nombreuses mutations somatiques dans cette maladie.

Immunopathologie du sida

(Responsable non identifié)

Antécédents La perte sélective des lymphocytes CD4 est le fait marquant de l'infection par le VIH. Bien que la déplétion de la population CD4 soit le mécanisme principal par lequel le virus induit le syndrome d'immunodéficience, de nombreuses anomalies fonctionnelles ont été rapportées dans les cellules CD4, CD8, NK, cellules B et les monocytes/macrophages. Depuis 1988, nous nous sommes intéressés à l'étude des sous-populations CD4, CD8 et NK, pendant l'infection par le virus VIH. Ces études ont réussi à établir l'existence d'une anergie fonctionnelle des sous-populations cellulaires CD4, CD8 et NK, déjà présente aux stades initiaux de la maladie, à un moment où les cellules CD4 n'accusent pas une diminution marquée (1992,1992,1996). Nos travaux ont permis de montrer pour la première fois, que le défaut prolifératif observée dans les cellules CD4 est directement corrélé à un déficit dans le processus de phosphorylation des tyrosines, à une expression diminuée de la tyrosine-kinase p56lck et à une expression augmentée de la p59fyn. Cet aspect biochimique est très proche de celui retrouvé dans des clones murins anergiques, où l'on observe la triade déficit de phosphorylation, sous-expression de p56lck et surexpression de p59fyn (1994). Nous avons aussi pu prouver que le stress oxydatif chronique jouait un rôle majeur dans l'altération très profonde de la réponse proliférative observée dans les lymphocytes CD4 des sujets infectés par le VIH et qu'un traitement anti-oxydant était capable de rétablir une réponse proliférative très perturbée et la fonction phosphatase de la molecule CD45 (1996). Pour évaluer le rôle potentiel des superantigènes, dans le défaut fonctionnel des effecteurs du système immun, nous avons étudié la réponse des lymphocytes circulants des sujets infectés par le VIH, à la nucléocapside rabique. Nous avons pu montrer que la stimulation préalable par ce superantigène induisait un processus d'anergie fonctionnelle des lymphocytes périphériques, consécutive à l'augmentation considérable dans la sécrétion d'IL-4 et IL-10 (commutation Th1-Th2) (1994). Projet de recherche Etude de la reconstitution immunologique des malades infectés par le virus VIH après trithérapie. (Daniel Scott-Algara) Dans le cadre du protocole TRILEGE, nous étudions la reconstitution immunologique chez des malades atteints par le VIH, au stade asymptomatique et n'ayant pas reçu du traitement au préalable. Les premiers résultats indiquent que la reconstitution immunologique est le plus souvent satisfaisante chez les malades répondant au traitement, puisqu'une récupération très importante des sous-populations CD4, des réponses prolifératives et des réponses spécifiques aux antigènes du VIH sont souvent observées.



Work from the Immuno-hématologie and Immuno-pathologie Unit has been has been devoted to: I) Natural autoantibodies (NAAB) and autoimmunity; II) Chronic lymphocytic leukemia (CLL) and B cell malignancies and III)Immunopathology of AIDS. As concerns NAAB, our work focused on the creation of a transgenic murine model of human cold agglutinin disease, the structural basis of NAAB polyreactiviy and, in a particular model , the role of isotype in the binding of Ig to antigen. With the aim of better defining the role of the B cell receptor in the process of malignant transformation of B cells we have started the study of of this receptor in 18 different families including at least two members affected with the disease. Finally, we have studied immune reconstitution in previously untreated asymptomatic HIV-infected patients, treated with a classical tritherapy treatment.