UNITÉ DE GÉNÉTIQUE MOLÉCULAIRE DES VIRUS RESPIRATOIRES

Responsable
VAN DER WERF Sylvie

e-mail : svdwerf@pasteur.fr


Département de Virologie
Institut Pasteur
25/28 Rue du Dr. Roux
75724 PARIS Cedex 15

Tél
01 4568 8725
Fax
01 4061 3241

Secrétariat

NAUBRON Christine, IP

Chercheurs permanents

ESCRIOU Nicolas, IP
MANUGUERRA Jean-Claude, IP
NAFFAKH Nadia, CNRS

Stagiaires de recherche

BARAKAT Amal, Stagiaire
MEDEIROS Rita, DEA
VIGNUZZI-FABBRI Marco, Thèse

Ingénieurs Techniciens Administratifs

CRESCENZO-CHAIGNE Bernadette, IP
DINTRAS Françoise, IP
GERBAUD Sylvie, IP
RIJKS Ida, IP
ROUSSEAU Monique, IP
ROUSSEAUX Claudine IP
TARDY-PANIT Maryse, IP

L'unité de Génétique Moléculaire des Virus Respiratoires a été créée en Novembre 1995. Lui sont rattachés, le Centre National de Référence de la Grippe (France-Nord) et le Centre Collaborateur de l'OMS pour la Recherche et la Référence sur les Virus Respiratoires.



Surveillance et Référence des Virus Respiratoires

(S. van der Werf)

Au titre du Centre National de Référence de la Grippe (France-Nord) et du Centre Collaborateur de l'OMS pour la Recherche et la Référence sur les Virus Respiratoires, l'unité recueille les données microbiologiques, sérologiques et épidémiologiques d'activité sanitaire et médicale, concernant les infections respiratoires respectivement auprès du réseau RENAL (30 laboratoires hospitaliers associés au CNR France Nord) et auprès de l'ensemble des médecins sentinelles, généralistes et pédiatres, du réseau des GROG (Groupes Régionaux d'Observation de la Grippe) d'Ile-de-France et des GROG militaires. L'analyse statistique de ces données fait l'objet de différents bulletins d'information hebdomadaires spécifiques et permet au Centre de contribuer à l'effort de surveillance au niveau européen, par échange télématique des données dans le cadre du groupe EISS (European Influenza Surveillance Scheme), ainsi que par l'animation du groupe d'échange d'informations EUROGROG. Ce dispositif d'alerte précoce a permis au CNR de détecter l'arrivée en France-Nord des premiers virus grippaux apparentés au variant A/Wuhan/359/95(H3N2) dès la semaine 96-42 soit 5 semaines avant le début de l'épidémie de grippe. L'épidémie de virus A(H3N2) dont le pic s'est situé en France-Nord au cours des semaines 96-50 & 51, s'est avérée la plus forte des 5 dernières années tant en intensité qu'en sévérité, touchant toutes les tranches d'âge et principalement les 10-14 ans. Elle a été suivie à partir de la semaine 97-04, d'une deuxième vague épidémique beaucoup moins importante due au virus grippal de type B. Parallèlement le Centre réalise l'isolement, l'identification et la caractérisation antigénique des virus respiratoires à partir des prélèvements de cas d'infections respiratoires de type syndrome grippal qui lui sont adressés. Ainsi, 2129 prélèvements et souches virales ont été traités au cours de la saison 96/97, parmi lesquels 786 virus A (H3N2) et 164 virus de type B ont été identifiés au Centre. Des développements sont en cours pour appliquer la technique de RT-PCR à la détection en routine des virus grippaux afin de réaliser d'emblée le typage et le sous-typage des virus sans avoir à attendre leur isolement. Parallèlement, nous poursuivons la mise au point de tests ELISA par immunocapture, analogues à ceux mis en oeuvre pour la détection directe des virus grippaux de type A et B dans les prélèvements rhino-pharyngés, destinés à la détection directe du Virus Respiratoire Syncytial (VRS), d'une part et du virus grippal de type C, d'autre part.

Épidémiologie Moléculaire et Variabilité Génétique des Virus Grippaux

(S. van der Werf)

En relation avec l'activité de référence, de façon à suivre l'évolution génétique des virus grippaux au niveau de leurs glycoprotéines de surface et établir leur filiation, des études d'épidémiologie moléculaire par RT-PCR puis analyse par séquençage sont développées dans l'unité, notamment dans le cadre du groupe d'étude de la grippe créé cette année et regroupant différents laboratoires du Réseau des Instituts Pasteur et Institus Associés.

Production de virus vaccinal en culture de cellules

(S. van der Werf)

Cette étude initiée en 1993 dans l'unité d'Ecologie Virale suite aux recommandations faites lors des sixièmes rencontres sur l'étude et la prévention de la grippe à Berlin, a pour objectif d'explorer la possibilité de réaliser la production de virus vaccinal en culture de cellules comme alternative à la production actuelle sur oeuf de poule embryonné, difficilement compatible avec les délais de production massive qu'imposerait l'émergence d'un nouveau réassortant de virus grippal à potentiel pandémiogène. Il a été montré que la production du virus grippal à haut titre peut être obtenue sur cellules MDCK en milieu sans sérum dénué de toutes protéines d'origine animale dans des conditions compatibles avec les exigences de la production industrielle.

Génétique Moléculaire des complexes Transcriptase/Réplicase des virus grippaux

(S. van der Werf)

Les processus de transcription et de réplication du génome des virus grippaux se déroulent au sein des nucléocapsides associées à la nucléoprotéine (NP) et mettent en jeu des complexes fonctionnels distincts qui font intervenir les mêmes protéines PB1, PB2 et PA. Dans le but d'identifier les déterminants moléculaires portés par les gènes du complexe transcriptase/réplicase impliqués dans les phénomènes de réassortiment et de transmission inter-espèces susceptibles d'intervenir lors de l'émergence de virus grippaux à potentiel pandémiogène, nous avons initié le clonage moléculaire des gènes du complexe transcriptase/réplicase des virus de type B et C ainsi que des virus de type A aviaires, les cADN des virus de type A humains étant d'ores et déjà disponibles. La dissection génétique des interactions fonctionnelles au sein de complexes transcriptase/réplicase hétérotypiques (A, B ou C) et hétérospécifiques (aviaires, humains) est abordée par le biais d'un système d'expression transitoire en cellules eucaryotes permettant de suivre les processus de transcription/réplication d'un miniréplicon porteur d'un gène rapporteur.

Immunogénicité et rôle protecteur de peptides " non-immunodominants " de la nucléoprotéine du virus grippal de type A

(JC Manuguerra, collaboration K. Kosmatopoulos)

Alors que l'immunité post-vaccinale contre les virus grippaux est presque exclusivement une immunité à médiation humorale, l'immunité post-infectieuse comporte une importante composante de médiation cellulaire directe dont la nucléoprotéine est la cible principale. Chez la souris C57Bl/6 (H2b) infectée par le virus A/PR/8, la réponse est dirigée contre un seul peptide dit " immunodominant " présenté par la molécule Db, alors que la NP comporte trois autres peptides " non-immunodominants " répondant à la séquence consensus du motif Db et capables de se fixer à la molécule Db avec une affinité intermédiaire ou faible, mais vis à vis desquels aucune activité T-cytotoxique ne peut être mise en évidence ex vivo. Nous avons montré que l'immunisation des souris avec les peptides non-immunodominants induit une protection dans une plus faible proportion que le peptide immunodominant vis à vis d'une injection d'épreuve avec une dose létale de virus A/PR/8. De plus, l'intensité et l'étendue des lésions pulmonaires chez les souris survivantes est inversement proportionnelle à l'affinité de fixation du peptide à la molécule Db. C'est pourquoi, nous avons analysé l'immunogénicité de peptides hybrides dérivés des peptides " non-immunodominants " dans lesquels les acides aminés qui influencent négativement leur affinité pour la molécule Db ont été remplacés par les acides aminés correspondants du peptide immunodominant. Après immunisation avec ces peptides hybrides, une activité CTL spécifique qui peut atteindre des niveaux proches de ceux obtenus avec le petide immunodominant est détectée ex vivo, tant lors d'une sensibilisation des cellules cibles avec les peptides hybrides qu'avec les peptides non-immunodominants à faible affinité. Les peptides hybrides utilisés pour la vaccination augmentent la clairance virale et protègent contre la mortalité et les lésions anatomopathologiques de manière comparable au peptide immunodominant. L'analyse de la réponse CTL spécifique dirigée contre les peptides issus de la nucléoprotéine du virus grippal ainsi que son influence sur la variabilité génétique virale se poursuivent à l'aide d'un modèle de souris transgéniques.

Réplicons recombinants défectifs polio- et Mengo-influenza

(N. Escriou)

Du fait de l'incapacité des vaccins grippaux inactivés actuellement employés à conférer une immunité humorale locale de type sécrétoire et une immunité cellulaire de type T-cytotoxique en plus de l'immunité humorale générale, le développement d'un vaccin susceptible de conférer une immunité durable et à large spectre contre l'infection grippale suscite un grand intérêt. Nous nous proposons d'aborder cette question par le biais de l'étude de l'immunogénicité de réplicons recombinants dérivés du génome du poliovirus ou du Mengo virus et permettant l'expression de différentes séquences du virus grippal, notamment de l'hémagglutinine (HA) ou de la nucléoprotéine (NP). Ayant défini préalablement quelles sont les séquences minimales nécessaires à la réplication du génome viral, les séquences non essentielles pour la réplication sont substituées par différentes séquences du virus influenza de façon à les exprimer de façon essentiellement indépendante de la polyprotéine du Picornavirus correspondant. La capacité de tels réplicons recombinants à induire une réponse humorale ou de type T-cytotoxique est à l'étude chez la souris selon différentes modalités d'immunisation, et leur capacité à induire une réponse protectrice vis à vis de variants du virus grippal de même sous-type voire de sous-type différent sera évalué dans le modèle murin d'infection létale par le virus grippal.