UNITÉ DE GÉNÉTIQUE MOLÉCULAIRE

Responsable
PUGSLEY Anthony P.

e-mail : max@pasteur.fr


CNRS URA 1773

Département de Biologie Moléculaire
Institut Pasteur
25/28 Rue du Dr. Roux
75724 PARIS Cedex 15

Tél
01 4568 8494
Fax
01 4568 8960

Secrétariat

LAVENIR Armelle, IP

Chercheurs permanents

DANOT Olivier, IP
POSSOT Odile, IP
PUGSLEY Anthony, IP
RICHET Évelyne, CNRS

Stagiaires de recherche

BOMCHIL Natalia, DEA
FRANCETIC Olivera, Post-doc (Dr)
NOUWEN Nico, Post-doc (Dr), stagiaire de la CEE
SAUVONNET Nathalie, Post-doc
SCHREIBER Valérie, Thèse
SEYDEL Anke, Thèse

Ingénieurs Techniciens Administratifs

GUILVOUT Ingrid, IP
NADEAU Nathalie, IP
REYNGOUD Maria, IP
VIDAL-INGIGLIARDI Dominique, IP

L'Unité de Génétique Moléculaire s'intéresse à deux aspects de la biologie moléculaire des bactéries : la régulation de l'expression génétique par des activateurs transcriptionnels (systèmes modèles : protéines MalT et CRP d'Escherichia coli ) et la sécrétion des protéines extracellulaires (système modèle, la pullulanase de Klebsiella oxytoca, dont la synthèse est régulée par les protéines MalT et (indirectement) CRP). Les protéines intervenant dans ces processus ont été caractérisées, et nous étudions leurs interactions pour comprendre les mécanismes moléculaires mis en oeuvre.



Régulation du système maltose d'Escherichia coli

(E. Richet)

Les entérobactéries telles que Escherichia coli et Klebsiella oxytoca sont capables d'utiliser comme source de carbone une série de sucres obtenus par hydrolyse de l'amidon (maltose et maltodextrines). Pour ce faire, ces bactéries possèdent un système extrêmement élaboré, le système maltose, qui comprend au moins 20 protéines localisées dans tous les compartiments cellulaires. Depuis quelques années, nos travaux portent sur la régulation de l'expression de 5 des 7 opérons codant pour ces protéines. La transcription de ces opérons est sous le contrôle de 2 protéines régulatrices : MalT, l'activateur spécifique du système maltose, et CRP (protéine réceptrice de l'AMPc), un activateur global contrôlant l'expression de nombreux opérons impliqués dans le catabolisme des sucres. L'activité de la protéine MalT nécessite la présence de l'ATP et d'une petite maltodextrine, le maltotriose. Notre objectif est d'élucider les mécanismes moléculaires par lesquels MalT, seul ou en coopération avec CRP, stimule le démarrage de la transcription au niveau des promoteurs du système, et de comprendre le rôle des effecteurs, le maltotriose et l'ATP. Les protéines de grande taille comme MalT, dont la chaîne polypeptidique comprend 901 acides aminés, sont généralement constituées de plusieurs domaines qui se replient indépendamment du reste de la protéine et conservent leur activité une fois isolés. Ceci nous a incités à entreprendre une analyse de l'anatomie fonctionnelle et structurale de MalT en disséquant la protéine par des méthodes génétiques et biochimiques. L'isolement de domaines impliqués dans les différentes fonctions de la protéine est en cours. En particulier, nous avons montré que le polypeptide comprenant les 100 derniers acides aminés de MalT (homologue aux régions correspondantes d'une quarantaine d'autres protéines activatrices issues de genres bactériens variés) constitue le domaine de fixation à l'ADN de MalT, et qu'il est capable d'activer faiblement certains promoteurs du régulon maltose. Nous avons isolé plusieurs mutations affectant cette propriété et identifié ainsi deux acides aminés spécifiquement impliqués dans l'activation par ce polypeptide. A présent, notre but est de comprendre le rôle de ces résidus dans l'activation par la protéine MalT entière des différents promoteurs du régulon maltose. Nous envisageons en particulier l'hypothèse d'une interaction de ces acides aminés avec l'ARN polymérase. Dans le but de comprendre la structure des complexes nucléoprotéiques que la protéine MalT forme avec les différents types de promoteurs maltose (ces promoteurs présentant une grande variété structurale de par le nombre et la position des sites de fixation de MalT nécessaires à leur fonctionnement), nous avons entrepris de déterminer, en utilisant des approches biochimiques et biophysiques, la structure quaternaire de la forme active de MalT (ie, de MalT complexé à l'ATP et au maltotriose). Enfin, nous nous attachons à comprendre comment MalT et CRP activent de manière synergique le promoteur malEp. malEp est un promoteur complexe dont l'activation dépend de la formation d'un complexe nucléoprotéique impliquant cinq sites de fixation de MalT et trois sites de fixation de CRP. En combinant études in vivo et in vitro, nous avons montré en particulier que CRP joue deux rôles dans ce processus d'activation : (i) il stabilise le complexe nucléoprotéique en courbant l'ADN au niveau de ses sites de fixation, et (ii) l'une des molécules de CRP intervient également directement en contactant soit l'ARN polymérase, soit la protéine MalT.

La sécrétion : la pullulanase

(A.P. Pugsley)

Les protéines extracellulaires sécrétées par les bactéries telles que K. oxytoca doivent franchir les deux membranes de la cellule (la membrane cytoplasmique et la membrane externe) pour atteindre le milieu extérieur. La pullulanase possède un peptide signal classique nécessaire à son transport à travers la membrane cytoplasmique par la voie générale d'exportation dans laquelle les protéines Sec interviennent. Pour franchir la membrane externe, la pullulanase emprunte une deuxième voie qui lui est spécifique, et dans laquelle interviennent 14 protéines codées par les gènes pul. Ces gènes, ainsi que le gène de structure de la pullulanase, sont regroupés dans le chromosome de K. oxytoca. Leur expression chez E. coli conduit à la synthèse et à la sécrétion spécifique de la pullulanase. La pullulanase constitue donc un excellent modèle d'étude pour de nombreuses voies similaires de sécrétion qui, chez diverses bactéries pathogènes à Gram négatif, facilitent la sécrétion de facteurs de virulence (toxines, protéases et autres hydrolases). Nous étudions plusieurs aspects de la sécrétion de la pullulanase. Tout d'abord, il semble que la pullulanase acquiert sa structure tertiaire, indiquée par la présence d'au moins un pont disulfure, lors de son transit par le périplasme entre les deux membranes. De plus, nos résultats antérieurs semblent indiquer que la formation de pont(s) disulfure(s), catalysée par une disulfide oxido-reductase périplasmique (DsbA), est nécessaire pour que la pullulanase soit efficacement sécrétée. Ceci implique que la pullulanase traverse la membrane externe sans être dépliée. Deux régions de la protéine, chacune de 80 acides aminés environ, semblent nécessaires et suffisantes pour la sécrétion de la pullulanase. Curieusement, aucune de ces deux régions ne contient de pont disulfure. Comment, donc, expliquer que la sécrétion efficace de la pullulanase semble nécessiter la DsbA, dont la seule fonction connue est de promouvoir la formation de ponts disulfures? Pour répondre à cette question, nous avons étudié un variant incapable de former un pont disulfure. Ce variant est moins actif et moins abondant que la pullulanase naturelle, mais sa sécrétion ne semble pas être affectée. Le rôle de la protéine DsbA semble, donc, indirect. La possibilité qu'elle intervienne au niveau de l'assemblage de la machinerie de sécrétion est actuellement à l'étude. Les interactions éventuelles entre les protéines qui composent le sécréton sont étudiées par des techniques biochimiques (pontage chimique, co-purification, co-immunoprecipitation) ainsi que génétiques (recherche de mutations et de suppresseurs ; systèmes deux-hybrides, construction de protéines et de systèmes hybrides). PulD, la seule protéine de la membrane externe spécifiquement requise pour la sécrétion, forme un complexe qui ne peut pas être dissocié par chauffage à 100°C en présence de SDS. Dans d'autres laboratoires, il a été montré que plusieurs autres protéines similaires à PulD forment également des complexes qui résistent au SDS. Ces protéines, toutes impliquées dans le transport de macromolécules à travers la membrane externe de bactéries à Gram-négatif, s'appellent sécrétines. La sécrétine PulD, purifiée dans des conditions non-dénaturantes, est composée de deux polypeptides : la protéine PulD et la protéine PulS, initialement caractérisée comme un chaperon nécessaire pour l'insertion de PulD dans la membrane externe. L'analyse du complexe par microscopie électronique (en collaboration avec Andreas Engel de l'Université de Bâle et Helen Saibil de l'Université de Londres) indique la présence de 12 sous-unités de chaque protéine qui forment un tonneau. Le complexe purifié est également capable de former des pores dans une bicouche lipidique artificielle (en collaboration avec Alexandre Ghazi de l'Université de Paris Sud). Des analyses en cours doivent nous permettre de mieux préciser le rôle d'autres composants du sécréton dans le passage de la pullulanase à travers le pore formé par la sécrétine, les facteurs qui contrôlent l'ouverture et la fermeture du pore, le rôle d'énergie dans la sécrétion et les facteurs qui déterminent que seule la pullulanase peut traverser le pore.

La sécrétion et la piliation chez Escherichia coli K-12

(A. Pugsley)

Plusieurs gènes (appelés gsp) homologues aux gènes pul de K. oxytoca existent dans le chromosome d'E. coli K-12. La fonction de ces gènes reste à déterminer. D'autre part, il existe une homologie entre certains des gènes codant des composants du sécréton (les gènes pul ou gsp) et des gènes impliqués dans la formation de pili de type IV chez certaines bactéries pathogènes. Ces gènes existent eux aussi chez E. coli K-12 et dans la plupart des autres souches d'E. coli que nous avons examinées. Une fois de plus, il semble que ces gènes ne soient pas exprimés, du moins chez E. coli K-12. Nous cherchons donc des conditions (conditions de croissance, mutations affectant un régulateur éventuel) qui déréprime l'expression de tous ces gènes. À long terme, nous espérons exploiter ce système "cryptique" d'E. coli K-12 pour étudier les mécanismes moléculaires de l'assemblage de pili de type IV. Parmi ces gènes, nous en avons caractérisé deux qui codent chacun une enzyme, appelée prépiline petidase, dont la fonction est de cliver et de métyler les produits des sous-unités du pilus ou certains composants du sécréton. Ces deux enzymes sont actives, lorsque leurs gènes de structure sont exprimés à partir d'un promoteur hétérologue. Ces résultats indiquent que les deux systèmes de sécrétion et de piliation d'E-coli K-12 ou d'autres souches sont encore actifs, bien que nous n'ayons pas encore trouvé les conditions nécessaires pour leur expression naturelle.



The Molecular Genetics Unit is actively involved in two aspects of molecular microbiology research : the regulation of the expression of genes involved in maltodextrin catabolism by the activator proteins MalT and CRP in E. coli, and the secretion of extracellular proteins, notably pullulanase of Klebsiella oxytoca (whose synthesis is controlled by MalT and, indirectly, by CRP). Proteins involved in these processes have been characterized and we are studying their interactions in order to understand the molecular mechanisms involved in transcription activation and secretion.