UNITÉ DE BIOCHIMIE CELLULAIRE

Responsable
GOLDBERG Michel

e-mail : goldberg@pasteur.fr


CNRS URA D1129

Département de Biochimie et Génétique Moléculaire
Institut Pasteur
25/28 Rue du Dr. Roux
75724 PARIS Cedex 15

Tél
01 4568 8386
Fax
01 4061 3043

Secrétariat

LENOIR Lucile, IP

Chercheurs permanents

BLONDEL Arnaud, IP
BEDOUELLE Hugues, CNRS
CHAFFOTTE Alain-François, IP
de CRÉCY-LAGARD, IP
DJAVADI Lisa, CNRS
ENGLAND Patrick, IP
FRIGUET Bertrand, Université Paris 7
GOLDBERG Michel, Université Paris 7 - IP
GUEZ-IVANIER Valérie, IP
LADANT Daniel, CNRS
MARLIERE Philippe, IP
MAZEL Didier, IP
ROSE thierry, IP
ULLMANN Agnès, IP

Stagiaires de recherche

BENSAADA Mustapha, Thèse
BOUZON Madeleine, Post-doc
CONCONI Mariangela, Thèse
DORING Volker, Post-doc
GEORGESCU Roxana, Thèse
GMIRA Sakina, Thèse
KARIMOVA Gouzel, Post-doc
MOOTZ Henning, Thèse
PARK Yung-Chul, Thèse
PINET Agnès, DEA
RONDARD Philippe,Thèse
ROUX Pascale,Thèse

Ingénieurs Techniciens Administratifs

BELLALOU Jacques, IP
EXPERT-BEZANÇON Nicole, IP
GIRARD Marie-José, CNRS
GUILLOU Yvonne, CNRS
KIEFER-BIASIZZO Hélène, IP
METEZEAU Philippe, IP
NAGEOTTE Roland, IP
TASHAKORI GHANBARIAN Alice, Université Paris 7

Les travaux de l'Unité portent sur divers problèmes liés à la structure et à l'intégration des protéines dans plusieurs fonctions cellulaire: l'acquisition de la structure fonctionnelle des protéines, les aspects énergétiques de leurs interactions, l'origine atomique de leur stabilité et de leur fonction, l'utilisation comme agents vaccinants de protéines modifiées par "greffage" de peptides artificiels, l'évolution forcée de protéines vers l'apparition de nouvelles fonctions.



Repliement des protéines

(Michel Goldberg)

Ces recherches portent sur la connaissance, au niveau fondamental, des mécanismes qui permettent à une protéine d'acquérir en quelques secondes la stucture tridimensionnelle complexe qui lui confère ses propriétés biologiques. Les connaissances ainsi acquises sont utilisées pour améliorer la structuration des protéines, en particulier dans des processus industriels liés aux biotechnologies.

Etude des intermédiaires précoces de repliement

(Alain-F. Chaffotte)

L'approfondissement du mécanisme cinétique de dépliement et de repliement d'une protéine bactérienne, la thiorédoxine, et l'étude du processus de sa réactivation ont conduit à un affinement du schéma de repliement de cette protéine. Nous avons en particulier montré que l'état intermédiaire très précoce qui se forme en moins de 3 millisecondes est hétérogène et provient d'au moins 3 sous-populations, présentes à l'état dénaturé, produisant chacune de manière indépendante un intermédiaire distinct. L'un de ces intermédiaires produit l'état actif en moins d'un dixième de seconde, alors que les deux autres générent un 4ème intermédiaire commun dont la réactivation est très lente (plusieurs minutes). L'étude menée parallèlement sur la reconstitution de la thioredoxine à partir de 2 fragments complémentaires a abouti à une description quantitative du mécanisme complexe d'assemblage et de repliement de ces fragments dont certaines étapes ont permis de caractériser certains évènements structuraux intervenant dans le repliement de la protéine entière. Nous avons par ailleurs poursuivi l'étude du couplage entre la formation d'interactions à longue portée (les ponts disulfures) et l'apparition de structures locales (les alpha-hélices et les brins beta de la structure secondaire) lors des étapes précoces du repliement d'une protéine modèle particulièrement bien adaptée, le lysozyme de poule. Pour cela, 4 doubles mutants ont été construits dans chacun desquels les 2 cystéines engagées dans l'un des 4 ponts S-S ont été remplacées par 2 alanines. Les protéines correspondantes exprimées dans E. coli ont été caractérisées et leur purification à partir de corps d'inclusion est en cours. Par ailleurs, en collaboration avec le Prof. Ruoppolo de l'Université de Salerne (Italie) nous avons mis au point une méthode de marquage chimique du lysozyme en cours de repliemùent, et d'analyse des produits marqués par spectrométrie de masse, permettant de suivre la formation des ponts disulfures. L'application de cetrte méthode aux mutants du lysozyme devrait permettre de préciser le rôle de chacun des ponts disulfures.

Utilisation de sulfobétaines non détergentes pour améliorer le repliement in vitro

(Michel Goldberg)

La renaturation in vitro, fréquemment utilisée pour la préparation de protéines produites par manipulations génétiques, est souvent très peu efficace du fait de la formation de molécules mal repliées, insolubles, inactives. En collaboration avec une équipe du CEA de Grenoble, nous avons étudié une famille de molécules, les sulfobétaines non détergentes, dont certaines s'avèrent être d'excellents "adjuvants" qui minimisent la formation de protéines mal repliées, et améliorent considérablement l'efficacité de la renaturation. Après avoir démontré l'efficacité de ces molécules dans l'amélioration de la renaturation de plusieurs protéines animales et bactériennes, nous avons abordé l'étude de leur mécanisme d'action et démontré qu'elles agissent à un stade très précoce du repliement, en empêchant la formation d'agrégats et la formation d'intermédiaires situés hors du chemin productif de repliement.

Modélisation moléculaire

(Arnaud Blondel)

Les activités du groupe sont axées sur l'étude expérimentale et théorique des associations entre macromolécules biologiques, la modélisation de telles associations impliquées dans l'activation du système immunitaire et, en collaboration avec M. Karplus et D. Moras de l'IGBMC à Strasbourg, à la modélisation de mécanismes d'activation par des hormones. Les outils physico-chimiques et théoriques nécessaires pour étudier les associations entre macromolécules biologiques sont rassemblés dans le laboratoire. Cette synergie doit permettre d'approfondir notre compréhension des bases physiques de ces associations et de l'utiliser à des fins prédictives. Nos études sont réalisées sur une protéine faisant des associations avec elle-même. Des variants de cette protéine permettant de sonder l'importance des différents contacts de l'association ont été construits par génie génétique. Leurs associations sont caractérisées, sur le plan énergétique, par diverses méthodes physico-chimiques (fluorescence, ultra-centrifugation analytique, microcalorimétrie). En parallèle, l'énergie de ces associations est modélisée à l'aide d'un programme informatique, CHARMM, auquel nous avons apporté des modifications pour représenter un système de plus de 50000 atomes avec des méthodes de pointe adaptées pour utiliser efficacement les calculateurs à architecture parallèle (Cray T3E, SGI PowerChallenge etc...). La comparaison des données obtenus par le mesures physico-chimiques avec les résultats des modélisations permettra de tester, puis d'améliorer les paramètres du programme informatique en fonction de ces données. L'amélioration de ces paramètres est un enjeu très important pour la fiabilité des programmes de calculs d'interactions, de plus en plus utilisés dans la conception de nouveaux agents thérapeutiques. Les chercheurs de l'Unité d'Immunologie Moléculaire (Dir. O. Acuto) ont mis en évidence des interactions spécifiques entre certaines protéines impliquées dans la réponse des cellules du système immunitaire. Ces interactions forment une cible thérapeutique potentielle. Pour sonder le mécanisme d'activation, des mutations ont été introduites dans ces molécules. La modélisation a été appelée pour mieux comprendre l'interaction au niveau structural et l'effet des mutations. Pour aborder ce problème, nous avons mis au point une approche permettant de générer, par dynamique moléculaire accélérée, de nombreuses conformations de l'une des protéines, et de "trier" ces conformations en sous-ensembles par combinaison/groupage. Nous avons ainsi pu proposer un modèle qui permet de mieux comprendre l'association et d'expliquer les effets des mutations introduites. Un programme réalisé en collaboration avec l'ICGM (Strasbourg) vise à mieux comprendre les changements conformationnels des récepteurs nucléaires lors de la fixation d'hormones. Ces changements sont responsables d'une modification de l'état physiologique des cellules. La simulation que nous avons réalisée a conduit à proposer une séquence de mouvements concertés du récepteur et de l'hormone lors de sa fixation et d'obtenir ainsi une image, à l'échelle atomique, du mécanisme en bonaccord avec les donnés expérimentales disponibles.

Ingénierie des protéines

(Hugues Bedouelle)

Nos travaux ont porté sur les mécanismes de reconnaissance entre anticorps et antigène, et sur la stabilité des protéines. Durant la phase secondaire de la réponse immunitaire contre un antigène, des mutations somatiques spontanées augmentent progressivement l'affinité des anticorps. Leur analyse serait utile pour améliorer les anticorps en les manipulant rationnellement en vue d'applications. Le gènes codant pour l'anticorps monoclonal mAb D1.3, dirigé contre le lysozyme, semble avoir subi 5 mutations somatiques, mais une seule concerne un résidu impliqué dans un contact direct avec le lysozyme (L-Tyr50). Nous avons reconstitué par mutagénèse le fragment variable Fv qui aurait résulté de la réponse immunitaire primaire (Fv primaire). Nous y avons ensuite réintroduit les 5 mutations somatiques potentielles une-à-une, puis en combinaison. L'interaction entre les Fvs mutants et le lysozyme a ensuite été étudiée quantitativement. Chacune des mutations somatiques contribuait à renforcer l'association de l'anticorps au lysozyme (d'un facteur 2 à 80) mais la mutation L-Y50N avait un effet prépondérant. Les effets des mutations n'étaient généralement pas additifs. L'analyse complète des résultats dira si chacune des mutations a été sélectionnée séparément et si leur ordre d'apparition est important. L'utilisation d'oligopeptides synthétiques comme vaccins nécessite une compréhension approfondie des immunoréactivités croisées entre protéines et oligopeptides. Un anticorps (mAb164) dirigé contre la protéine TrpB2 d'E. coli, reconnaît avec une forte affinité un undécapeptide synthétique constitué des résidus 273-283 de TrpB et appelé P11. Nous avons introduit15 mutations simples et 3 mutations doubles dans le peptide P11, soit isolé soit intégré dans la protéine entière, et nous avons étudié la réactivité croisée de mAb164 vis-à-vis de ces deux formes d'antigènes mutants. Les valeurs de l'énergie libre d'association (DG) entre mAb164 et les mutants de TrpB2 étaient fortement corrélées avec les valeurs de DG pour les mutants de P11. Cette corrélation a montré que mAb164 reconnaissait les versions intégrées et isolées des résidus 273-283 suivant des mécanismes très semblables. Quelques différences significatives entre les reconnaissances de TrpB2 et P11 ont suggéré une certaine adaptabilité de l'interaction. Les résultats obtenus ont également permis de caractériser la conformation de P11 reconnue par mAb164. On estime qu'environ 5 % des protéines ont une région désordonnée d'au moins 40 résidus consécutifs, sans qu'on connaisse bien le rôle de ce désordre. Par exemple, le domaine C-terminal (résidus 320-419) de la tyrosyl-tRNA synthétase de Bacillus stearothermophilus (TyrRS) est nécessaire à la fixation du tRNATyr et désordonné dans la structure cristalline. Il est utilisé comme prototype de domaine désordonné dans des algorithmes de prédiction. Nous avons réalisé une construction génétique qui permet de produire et purifier le domaine C-terminal isolé en grande quantité. Nous avons ensuite montré qu'il possède une structure tridimensionnelle définie, stable et compacte. De façon inattendue, le désordre apparent du domaine C-terminal dans les cristaux est donc dû non pas à un défaut de structuration, mais à sa grande mobilité dans les cristaux. La structure du domaine C-terminal isolé est en cours de détermination par des méthodes de résonance magnétique nucléaire, en collaboration avec le laboratoire de M. Delepierre. Pour déterminer la contribution de l'association entre sous-unités à la stabilité d'une protéine dimérique, nous avons étudié le dépliement de la tyrosyl-tRNA synthétase de B. stearothermophilus par l'urée dans des conditions d'équilibre, au moyen d'expériences de spectrofluorimétrie, de dichroïsme circulaire, et de chromatographie d'exclusion de taille. Ces expériences ont montré l'existence d'un équilibre entre l'état dimérique natif, un intermédiaire monomérique replié et le polypeptide déplié. La stabilité de l'association entre les sous-unités et la stabilité conformationnelle de l'intermédiaire monomérique ont été analysées quantitativement. Les résultats ont montré qu'un tiers de la stabilité de la molécule venait de son caractère dimérique et suggéré que la TyrRS s'est formée au cours de l'évolution par association de deux monomères stables mais inactifs.

Adénylcyclase de Bordetella pertussis

(Daniel Ladant)

Notre équipe s'intéresse à l'étude des relations structure-fonctions de la toxine adénylcyclase (AC) produite par la bactérie Bordetella pertussis, l'agent de la coqueluche. Cet enzyme sécrété constitue l'une des toxines essentielles de cet te bactérie. L'AC possède la capacité de pénétrer dans les cellules eucaryotes cibles où elle est activée par une autre protéine, la calmoduline (CaM), pour synthétiser activement de l'AMP cyclique qui altère le métabolisme cellulaire. Notre objectif est de déterminer les mécanismes d'intoxication des cellules cibles par la toxine AC, en combinant des approches génétiques et biochimiques, et parallèlement, d'utiliser la toxine AC comme système vecteur pour délivrer des antigènes vaccinants de type T CD8+ dans des cellules présentatrices d'antigènes (en collaboration avec l'équipe de C. Leclerc, Institut Pasteur). Nous avons au cours de l'année passée démontré le rôle essentiel des charges électrostatiques dans la translocation de la toxine à travers la membrane cytoplasmique des cellules cibles. Ces résultats nous ont permis de démontrer que le transport actif des épitopes T CD8+ (insérés dans les toxines AC recombinantes) dans le cytoplasme des cellules présentatrices d'antigènes est essentiel pour l'activation in vivo de lymphocytes T cytotoxiques spécifiques de ces épitopes. Ces connaissances sont actuellement appliquées à l'élaboration de toxines recombinantes portant des épitopes T CD8+ spécifiques de cellules tumorales, afin d'induire in vivo une immunité anti-tumorale. Un deuxième volet de nos travaux, concerne l'analyse fonctionnelle et structurale du domaine catalytique de la toxine et les applications potentielles qui en découlent. En particulier, nous avons très récemment mis au point un test génétique, basé sur la complémentation fonctionnelle de deux fragments du domaine catalytique de l'AC, qui permet de détecter, chez E.coli, par des tests phénotypiques simples des interactions protéine-protéine.

Régulation des facteurs de virulence de Bordetella pertussis

(Agnès Ullmann)

Chez Bordetella pertussis, l'agent de la coqueluche, l'expression des facteurs de virulence est contrôlée positivement par le locus bvg, codant pour les protéines Bvgs et BvgA, en réponse à des signaux de l'environnement. Ces protéines font partie de la famille des systèmes à deux composants. Au cours de cette année, nous nous sommes plus particulièrement intéressés aux mécanismes moléculaires impliqués dans l'activation de gènes de virulence et à l'identification des sites d'interaction de BvgA sur les promoteurs de gènes de virulence. Pour étudier la sélectivité et la spécificité de l'ARN polymérase de B. Pertussis au niveau des contacts protéines établis avec BvgA, nous avons construit des ARNs polymérases hybrides B. pertussis-E. coli. Ces polymérases hybrides ont été évaluées dans des systèmes de transcription in vitro. Les résultats obtenus ont permis de développer un modèle selon lequel différents facteurs de virulence seraient transcrits par la même machinerie de transcription selon des mécanismes différents. Nous avons étudié, d'autre part, la fixation de BvgA sur des sites spécifiques des promoteurs de gènes de virulence afin de caractériser la structure de ces sites. Nous avons montré que les éléments de reconnaissance pour l'interaction ADN-BvgA sont organisés en des motifs répétés inversés.

Génétique acquisitive

(Philippe Marliere)

Seule une fraction infime des constitutions chimiques compatibles avec la prolifération cellulaire a pu être explorée au cours de l'évolution des espèces. Nous avons entrepris de remanier génétiquement des lignées microbiennes pour leur faire adopter des processus moléculaires déviant de tous ceux rencontrés dans la nature. L'accès à de telles lignées peut être recherché en réallouant des codons à d'autres acides aminés que ceux spécifiés par le code génétique usuel. Une tentative a été entreprise pour forcer l'incorporation de cystéine en réponse aux codons AUU, AUC et AUA de l'isoleucine et AUG de la méthionine chez E. coli. Le croisement systématique de mutations faux-sens au site catalytique de la thymidylate synthase, occupé par une cystéine dans l'enzyme sauvage, avec des gènes synthétiques spécifiant des tRNA/Cys aux anticodons variables a montré que des souches portant des couples codons-anticodons complémentaires pouvaient être propagées indéfiniment sans apport exogène de thymidine. L'incorporation erronée de cystéine en réponse au codon AUA a aussi été imposée dans le site actif de l'amidase, un enzyme d'Helicobacter pylori absent chez E.coli. La propagation d'une mutation faux-sens de l'amidase chez E. coli en utilisant l'acétamide comme source d'azote fut rendue possible par surproduction conjointe de la cystéinyl-tRNA synthétase et du tRNA/Cys/AUA suppresseur, indiquant l'établissement d'un taux élevé d'incorporation de la cystéine à un codon isoleucine. L'efficacité de la cystéine dans la réallocation des codons peut être attribuée à son faible encombrement stérique et son caractère amphiphile, délinéant ainsi les contraintes qui gouvernent l'évolution du code génétique.

Cytométrie analytique

(Philippe Metezeau)

L'Unité a assuré le fonctionnement du service commun de Cytométrie analytique et préparative (SC 9 Inserm-Pasteur), équipé d'un cytomètre en flux-trieur de cellules, d'un cytomètre en image à balayage laser, d'un microscope confocal et d'un rotor à élutriation. Ce laboratoire a poursuivi ses recherches propres concernant l'étude comparative de la méthylation des chromosomes suivant qu'ils proviennent de cellules normales ou leucémiques. Les mesures quantitatives qui ont été réalisées ont permis de dégager l'intérêt d'aborder l'étude du caryotype non seulement sur des bases structurelles (séquences nucléotidiques) mais également fonctionnelles (méthylation des cytosines). Cette possibilité est apportée par la cytométrie en image. D'autre part, nous avons établi une méthodologie reproductible pour le microprélévement de fragments chromosomiques de grande taille et l'amplification de leur ADN. Cette dernière réalisation permet d'envisager la réalisation "à la demande" de sondes ADN spécifiques de bonne qualité. Le laboratoire a également poursuivi ses activités de service. Une vingtaine d'équipes ont en effet bénéficié de prestations de service pour réaliser 200 expériences environ, portant principalement sur la mesure de flux calciques, l'étude du cycle cellulaire, la quantification de récepteurs membranaires et la détection de parasites intracellulaires.

Enseignement

L'Unité a la charge de l'organisation du Cours de Biochimie des Protéines (Directeur A. Chaffotte) associé au DEA de "Structure, Fonction et Ingénierie des Protéines (Paris 6/ Paris 7/ Paris11/ ENS/ Polytechnique/ CEA)., et une partie importante de ce cours est réalisée par le personnel de l'Unité. Le service commun de cytométrie analytique participe également à plusieurs cours de l'Institut Pasteur, de l'INSERM et des Universités.



Reasearch in this Unit deals with a variety of problems related to the structure of proteins and their integration in several cellular functions such as the acquisition of the functional structure of proteins, the energetic aspects of their interactions, the atomic origin of their stability and function, the use of modified proteins carrying "grafted" artificial peptides for vaccination, and the evolution of proteins forced to acquire new non-natural functions.


Sites d'intérêt

http://www.pasteur.fr/units/BGM/