UNITE DES ARBOVIRUS ET VIRUS DES FIEVRES HEMORRAGIQUES

Responsable
DEUBEL Vincent

e-mail : vdeubel@pasteur.fr


INSTITUT PASTEUR

Département de Virologie
25, Rue du Dr Roux
75724 Paris cedex 15

Tél
01 4568 8000
Fax
01 4061 3774 / 3151

Secrétariat

DULIEU Isabelle

Chercheurs permanents

BILLECOCQ Agnès, IP
BOULOY Michèle, IP
DESPRES Philippe, IP
DEUBEL Vincent, IP
FLAMAND Marie, IP
LE GUENNO Bernard, IP
GALABRU Julien, CNRS
PREHAUD Christophe, IP

Stagiaires de recherche

COURAGEOT Marie-Pierre, Thèse
KOHL Alain , Thèse
MARIANNEAU Philippe , Post doctorant (Bourse Roux)
YADANI Fatima , Thèse

Ingénieurs Techniciens Administratifs

COUDRIER Daniel, IP
DROUET M.arie-Thérèse, IP
FRENKIEL Marie-Pascale, IP
MEGRET Françoise , IP
MURRI Séverine, IP
VIALAT Pierre, IP

Les arbovirus ont été initialement définis comme "maintenus dans la nature par un cycle de transmission biologique entre des hôtes vertébrés sensibles et des arthropodes hématophages". Or certains d'entre eux ne correspondent pas à cette définition, mais ont été classés dans le catalogue des arbovirus pour leur apparenté écologique et non taxonomique. Plus de 100 virus pathogènes pour l'homme à des degrés divers sont répertoriés dans le monde. Ces virus entrainent des lésions qui sont à l'origine des syndromes particuliers à chaque virus (syndromes fébriles algiques, syndromes méningo-encéphalitiques, syndromes hémorragiques) pouvant conduire à la mort de l'hôte. Les virus des fièvres hémorragiques appartiennent aux familles des Bunyaviridae, des Flaviviridae, des Arenaviridae et des Filoviridae. La majorité de ces virus circule sous les tropiques, en raison de l'abondance des hôtes et des vecteurs: c'est notamment le cas des virus de la fièvre jaune, de la dengue et de la fièvre de la vallée du Rift. Plusieurs d'entre ces virus sont cependant retrouvés dans les zones tempérées, en Europe centrale, de l'est et du sud. Au niveau national, trois virus majeurs peuvent préoccuper les centres de Santé Publique: le flavivirus de l'encéphalite à tique d'Europe centrale, le virus West-Nile introduit épisodiquement par les oiseaux migrateurs, et un bunyavirus apparenté au virus Hantaan dont le réservoir est un rongeur auprès duquel l'homme se contamine. Malgré de nombreux travaux, beaucoup d'inconnues demeurent aux niveaux fondamental et épidémiologique sur les flavivirus, les bunyavirus et les filovirus. Notre Unité a développé en particulier des recherches pour cinq viroses importantes qui peuvent conduire à des syndromes hémorragiques et qui posent de graves problèmes de Santé Publique dans plusieurs continents, et tout particulièrement dans les Départements et Territoires d'Outre-Mer ainsi que dans les pays où notre Institut est représenté: dengue, fièvre jaune, fièvre hémorragique à virus Ebola, fièvre hémorragique avec syndrome rénal (hantavirus), fièvre de la vallée du Rift. A l'interface de nos activités, de recherche et de référence, se situe le réseau d'étude des arbovirus auquel nous adhérons. Ceci nous permet d'étendre nos activités à nos partenaires privilégiés installés tout particulièrement dans le monde francophone. Ces collaborations sont une source inestimable d'échanges scientifiques qui favorisent le développement de la recherche grâce à des transferts d'information, de matériel et de technologies.



Le virus de la dengue

(Responsable non identifié)

La dengue est une maladie virale transmissible à l'homme par les moustiques du genre Aedes dans les régions tropicales et intertropicales qui ceinturent le globe. L'agent infectieux responsable de la maladie est un flavivirus (famille Flaviviridae) dont on distingue quatre sérotypes (dengue-1, -2, -3, et -4). L'infection par le virus dengue provoque généralement une fièvre non différenciée le plus souvent asymptomatique (fièvre dengue classique, DF, ou grippe des tropiques) mais peut entrainer des manifestations hémorragiques graves (fièvre hémorragique de la dengue, DHF), notifiées par une perméabilité vasculaire accrue et un déréglement de l'hémostase. L'issue de la maladie peut être fatale en cas de choc hypovolémique (dengue avec syndrome de choc, DSS). Les facteurs de l'hôte ou intrinsèques au virus responsables de la gravité de la maladie ne sont pas connus. Les thématiques de recherche développées au laboratoire ont comme ligne directrice l'étude des marqueurs moléculaires de la diversité biologique du virus de la dengue qui sont associés de manière critique à sa virulence et l'étude des mécanismes qui régissent les interactions du virus avec ses cellules hôtes.

Mécanismes de virulence du virus dengue

(P. Desprès)

Nous avons développé des approches expérimentales afin d'analyser des marqueurs de la virulence du virus dengue chez la souris. Nous avons démontré au cours de ces études que (A) les isolats humains du virus dengue infectent avec des efficacités différentes une cellule cible comme le neurone murin en culture, (B) l'assemblage des particules virales peut être défectif dans les cellules de mammifères, (C) le virus dengue peut induire la mort cellulaire par apoptose suite à une accumulation de protéines virales dans les membranes cellulaires et (D) la mort apoptotique est détectée dans les neurones du système nerveux central de la souris infectée par le virus.

Pathogénie liée au virus dengue

(P. Marianneau,)

Les organes cibles du virus de la dengue ne sont pas clairement identifiés. Cependant une atteinte hépatique a souvent été trouvée associée aux formes de DHF/DSS. Nous recherchons si les hépatocytes pouvent être des cellules cibles de l'infection par le virus de la dengue en étudiant les marqueurs de l'infection d'une lignée d'hépatome humain HepG2 sensible au virus de la dengue. Nous avons montré que le virus induit une mort cellulaire par apoptose dans les cellules HepG2 liée spécifiquement à l'activation du facteur de transcription NF-kB.

Etude des propriétés de la glycoprotéine non structurale NS1

(M. Flamand)

La glycoprotéine non structurale NS1 du virus de la dengue est une protéine virale très fortement représentée au sein de la cellule infectée ainsi que dans le milieu extracellulaire. La forme intracellulaire semble jouer un rôle dans la réplication virale et sa forme extracellulaire circulante pourrait être impliquée dans la pathogenèse du virus. Afin d'identifier le rôle éventuel de la protéine sécrétée, nous avons étudié son mode de maturation dans une lignée de rein de singe (Vero) et ses propriétés biochimiques. Nous avons montré que la forme sécrétée est hexamérique et se différencie de la forme intracellulaire au niveau antigénique et oligomérique. La forme dimérique de la protéine pourrait préférentiellement être associée aux membranes cellulaires et constituer un état précurseur de l'hexamère. La solubilité de la forme héxamérique sécrétée serait acquise lors de la transition dimère-hexamère en recrutant aux interfaces entre sous-unités dimériques les surfaces hydrophobes interagissant initialement avec les membranes. La protéine NS1 existe donc sous différents états oligomériques, et probablement fonctionnels, au cours de sa maturation.

Vaccinologie

(V. Deubel).

Il n'exite actuellement pas de vaccin contre la dengue. Nous avons développé au laboratoire un vaccin sous unitaire composé des protéines d'enveloppe des quatre sérotypes viraux. La protéine d'enveloppe recombinée du virus de la dengue a été exprimée dans le système du baculovirus et ses capacités vaccinantes ont été étudiées chez la souris et chez le singe. L'injection aux animaux de protéine recombinée purifiée induit des anticorps neutralisants et une immunité protectrice contre une dengue expérimentale.

Le virus de la fièvre de la Vallée du Rift

(Responsable non identifié)

Membre du genre phlebovirus, le virus de la fièvre de la vallée du Rift (FVR) est responsable de fièvres hémorragiques chez l'homme, d'avortements et malformations du foetus chez les ruminants. Ce virus enveloppé possède un génome composé de trois segments d'ARN (L, M, S) de polarité négative dont un, le segment S, est ambisens.

Les promoteurs de transcription

(C. Prehaud)

1. Le promoteur génomique Exprimées par des virus de la vaccine recombinants, les deux protéines virales L (ARN polymérase) et N (nucléoprotéine) assurent à elles seules la transcription d'ARN artificiels transfectés dans les cellules préalablement infectées. L'ARN utilisé comme matrice est un minigénome qui contient le gène CAT (Chloramphénicol Acetyle Transférase) en orientation antisens, flanqué des séquences génomiques 3' et 5' non codantes du segment S. Des mutations dans la région 3' terminale de la matrice montrent que le site de reconnaissance du complexe de transcription est localisé dans les 13 premiers nucléotides. Cette séquence correspond aux 8 premiers nucléotides conservés chez tous les phlébovirus, suivis de nucléotides variables aux positions 9 à 12, et d'une purine conservée dans toutes les séquences génomiques à la position 13. Cette dernière joue un rôle important: la substitution par une base pyrimidique abolit complètement la capacité de l'ARN à servir de matrice. D'autres mutations dans la région 5' montrent que les séquences 3' et 5' complémentaires inversées des extrémités ne sont pas indispensables pour la transcription mais facilitent l'association du complexe de transcription avec l'ARN . 2. Le promoteur antigénomique du segment S Le segment S présente la particularité d'utiliser une stratégie ambisens, ce qui implique que l'antigénome est également transcrit en un ARN messager. Ce dernier code pour la protéine non structurale NSs. Un ARN modèle de type antigénomique a été utilisé pour étudier cette phase de la transcription. Il est transcrit dans le système reconstitué et son promoteur présente les mêmes caractéristiques que celui de la molécule génomique.

Persistance du virus de la fièvre de la vallée du Rift

(A. Billecocq)

Les souches C13, MP12 et des souches sauvages du virus FVR établissent une infection persistante dans les cellules de mammifères. Certaines cultures de cellules Vero sont propagées depuis plus d'un an et continuent à héberger le génome viral ou des molécules qui en dérivent et à exprimer la protéine N et les glycoprotéines G1 et G2. L'infection persistante s'établit avec des efficacités différentes selon les souches. Le nombre de cellules qui survivent après la phase aigüe de l'infection primaire est clairement supérieur avec la souche C13. L'analyse de réassortants génétiques obtenus par co-infection des cellules avec les souches C13 et ArD 38661 (souche sauvage isolée au Sénégal) montre que l'un des déterminants génétiques de la persistance est lié au segment S. Des expériences sont en cours pour rechercher si la protéine NSs, qui présente une importante déletion dans la souche C13, joue un rôle dans l'établissement du phénomène.

Centre national de référence et Centre collaborateur OMS des Arbovirus et Virus des Fièvres Hémorragiques

(B. Le Guenno)

Le Centre national de référence (CNR) partage ses activités entre la mise au point de techniques diagnostiques et leurs applications au diagnostic individuel demandé par les praticiens et à l'étude de l'épidémiologie de certains de ces virus en France et à l'étranger. A. Mises au point de techniques Le CNR produit et distribue les réactifs nécessaires au diagnostic des principales arboviroses. Il travaille à l'amélioration des techniques et au transfert de celles ci par l'accueil de stagiaires venant principalement de pays tropicaux. Il dispose d'une collection de plusieurs centaines de souches représentant 56 arbovirus et virus des fièvres hémorragiques différents. Nous avons développé au profit du laboratoire de biologie médicale de l'Institut Pateur le diagnostic sérologique des principales arboviroses par capture d'IgM. Ebola: notre découverte de virus Ebola en Côte d'Ivoire et au Gabon en 1994 nous a amenés à nous intéresser tant au diagnostic des infections aiguës (IgM, PCR, capture d'antigène) qu'aux études de prévalence du portage d'anticorps (protéines recombinantes, Western Blot) (C. Préhaud, J. Galabru, B. Le Guenno, D. Coudrier, M. Bouloy). Hantavirus: Le diagnostic des affections liées à ces virus présents en France repose sur la sérologie maintenant bien au point. Par contre l'étude de la distribution des souches chez les rongeurs a nécessité le développement d'une technique de PCR. B. Epidémiologie En France existe la fièvre hémorragique avec syndrome rénal, affection due à des Hantavirus, Puumala dans le quart Nord Est et Seoul sur tout le territoire. Une enquête cas/témoins a permis de préciser les facteurs de risque, en particulier de prouver que le campagnol roussâtre, réservoir du virus pénètre dans les habitations situées en lisière de forêt. Le cycle épidémique de cette maladie est directement lié à la dynamique des populations du réservoir. Après l'épidémie de 1996, nous sommes dans un creux pour deux ans et seulement 60 ont été diagnostiqués cette année. Dans le domaine des Arbovirus, une maladie existe en France métropolitaine, l'encéphalite à tiques, dont le nombre de cas est de l'ordre de dix par an. Le Centre exerce une activité de surveillance des arboviroses d'importation. La dengue est l'affection la plus courante. Généralement bénigne, cette maladie donne parfois des formes hémorragiques. Le nombre de cas croit régulièrement en zone tropicale, en particulier dans les Caraïbes. La Martinique a particulièrement été touchée en 1997 et des cas de dengue hémorragique mortels ont été rapportés. Cette maladie est désormais courante chez les touristes. Une autre arbovirose moins fréquente mais plus grave est l'encéphalite japonaise dont aucun cas clinique n'a été diagnostiqué cette année. Dans note rôle de Centre collaborateur OMS, nous avons diagnostiqué et participé à l'étude d'une épidémie due au virus West-Nile, un arbovirus transmis d'oiseaux au cheval et à l'homme par des moustiques du genre Culex en Tunisie. 140 malades ont été hospitalisés pour syndrome neurologique entre le 7 Septembre et le 2 Décembre. Cette épidémie fait suite aux deux que nous avions diagnostiquées en 1995 en Roumanie et au Maroc et fait craindre la réapparition de cette maladie dans le sud de la France. C. Epidémiologie moléculaire Plusieurs techniques de diagnostic rapide (RT-PCR) et de caractérisation génétique par séquençage des souches d'arbovirus et virus des fièvres hémorragiques (Hantavirus, Ebola, RVF, dengue, West Nile, fièvre jaune) ont été mises au point (M. Bouloy, C. Prehaud, J Galabru, V. Deubel) et sont actuellement développées au CNR. Plusieurs de ces études sont réalisées dans le cadre de collaborations avec le réseau international des Instituts Pasteur et Instituts associés