e-mail : ntmarsac@pasteur.fr CNRS URA D1129
Département de Biochimie et Génétique Moléculaire
Institut Pasteur
25/28 Rue du Dr. Roux
75724 PARIS Cedex 15
Apparues il y a environ 3 milliards d'années, les cyanobactéries représentent un groupe bactérien majeur tant par leur diversité morphologique et physiologique que par le rôle qu'elles ont joué en créant une atmosphère aérobie sur notre planète et jouent, encore de nos jours, dans l'équilibre des proportions entre le CO2 et l'oxygène. En effet, ces organismes procaryotes partagent avec les plantes la capacité d'effectuer la photosynthèse en utilisant la lumière et l'eau pour la réduction du CO2, processus qui s'accompagne d'un dégagement d'oxygène. Possédant un très grand potentiel d'adaptation à des environnements, même extrêmes, elles colonisent la plupart des écosystèmes aquatiques et terrestres.
Les travaux de recherche réalisés dans l'Unité de Physiologie Microbienne sont organisés autour de deux axes majeurs : les mécanismes moléculaires de l'adaptation des cyanobactéries à l'environnement et la collection de souches de cyanobactéries (Pasteur Culture Collection ou PCC). La majorité de nos travaux sur l'adaptation à l'environnement sont effectués avec une souche unicellulaire non fixatrice d'azote Synechococcus PCC 7942 et avec des souches du genre Calothrix, cyanobactéries filamenteuses qui présentent des capacités d'adaptation à l'environnement remarquables : i) survie et dispersion de l'espèce dans son habitat naturel grâce à la différenciation des filaments végétatifs en hormogonies ; ii) fixation de l'azote moléculaire grâce à la différenciation de cellules spécialisées, appelées hétérocystes ; iii) adaptation pigmentaire en fonctionde l'intensité et de la qualité spectrale de la lumière incidente, de la sourced'azote combinée et de la disponibilité en soufre.
(J. Houmard et N. Tandeau de Marsac)
Coordination entre les métabolismes du carbone et de l'azote
Synechococcus PCC 7942 possède une protéine PII qui diffère de celle des entérobactéries par les caractéristiques suivantes : i) son type de modification post-traductionnelle (phosphorylation sur le résidu séryl49 au lieu d'une uridylylation du résidu tyrosyl51) ; ii) les conditions qui conduisent à sa modification, l'a-cétoglutarate étant un métabolite vraisemblablement plus important que la glutamine dans ce processus ; iii) son rôle, puisqu'elle intègre et coordonne à la fois l'assimilation de l'azote et l'activité photosynthétique de la cellule.
En collaboration avec E. Flores et A. Herrero (Centro de Investigaciones Scientificas de la Isla de la Cartuja, Espagne), nous avons montré que PII sous sa forme déphosphorylée bloque le transport actif des ions nitrate/nitrite, fonction nouvelle pour cette protéine dans le monde bactérien. En revanche, PII ne joue aucun rôle dans le transport des ions ammonium. Il existe donc des systèmes de contrôle indépendants pour ces deux sources d'azote. En collaboration avec le groupe de F. Joset (Laboratoire de Chimie Bactérienne, Marseille), nous recherchons actuellement si la protéine PII intervient aussi dans le contrôle du transport des substrats carbonés (CO2 et/ou HCO3-).
Pour optimiser leur capacité de capture de l'énergie lumineuse pour la photosynthèse, les cellules de Calothrix PCC 7601 synthétisent de la phycocyanine-1 (PC1, pigment bleu), et soit de la phycoérythrine (PE, pigment rouge) si les cellules sont exposées à de la lumière verte, soit de la phycocyanine-2 (PC2, pigment bleu) si elles sont sous lumière rouge. Cette adaptation chromatique dite "complémentaire" fait intervenir un ou plusieurs photorécepteurs, ainsi que des régulations à la fois transcriptionnelles et post-transcriptionnelles de la synthèse des protéines qui constituent les antennes photocollectrices (phycobiliprotéines et protéines de liaison). Les régulations transcriptionnelles impliquent au moins trois effecteurs RcaA, RcaB et RcaD. Par des expériences de transcription in vitro, il a été montré que RcaA est une protéine affine de l'ADN, capable d'activer et/ou de modifier la spécificité d'initiation de transcription pour quelques opérons codant pour des phycobiliprotéines. La spécificité de RcaA pour les promoteurs dépend de son état de phosphorylation. Quelle que soit sa forme, phosphorylée ou non, RcaA a le même effet sur la transcription des gènes de la PC1, alors que sa fonction d'activateur de la transcription des gènes de la PE requiert sa forme phosphorylée. Le gène rcaA a été caractérisé. La protéine correspondante est une glutamyl-ARNt synthétase. Cette enzyme connue pour son rôle dans la traduction des protéines et la biosynthèse des chromophores a donc une fonction supplémentaire, jusqu'à ce jour inconnue, dans la transcription des gènes qui codent pour les apoprotéines de certaines phycobiliprotéines.
Une forte accumulation d'AMP cyclique se produit lors de l'induction de la différenciation des filaments végétatifs en hormogonies chez Calothrix PCC 7601. En collaboration avec P. Glaser (Unité de Régulation de l'Expression Génétique, IP), nous avions identifié le gène cyaA . Ce gène code pour une adénylate cyclase de classe III, dite universelle, mais dont la structure est cependant unique en son genre, puisqu'elle comprend au moins trois modules : une partie N-terminale et une région centrale respectivement similaires aux protéines kinases et aux domaines régulateurs des systèmes à deux composants bactériens, et, en partie C-terminale, le domaine catalytique proprement dit. L'étude de la régulation de la synthèse et de l'activité de cette adénylate cyclase, ainsi que la détermination du rôle de l'AMP cyclique dans la voie de transmission des signaux qui conduit à la différenciation des hormogonies, sont en cours. L'événement qui suit la synthèse d'AMP cyclique étant une division cellulaire active, le gène ftsZ a été également caractérisé ; il constitue un marqueur supplémentaire pour suivre, au niveau moléculaire, les différentes étapes de la différenciation des filaments végétatifs en hormogonies.
Les vésicules à gaz, structures intracellulaires imperméables à l'eau, mais perméables aux gaz, présentes chez de nombreuses cyanobactéries, permettent aux cellules de flotter à la surface des lacs et des étangs. Dans l'optique de déterminer l'information génétique requise pour la synthèse de ces vésicules, le séquençage de la région en aval du gène de structure gvpA chez Pseudanabaena PCC 6901 a été réalisé. Trois nouveaux gènes ont été trouvés : l'un (orf1) pourrait correspondre à la protéine GvpC qui renforce la structure de la vésicule à gaz, et les deux autres à gvpN et gvpJ de l'archaebactérie Halobacterium halobium. La fonction de la protéine GvpN est inconnue. La protéine GvpJ présente des similitudes avec la protéine GvpA et pourrait donc être impliquée dans la formation d'une partie de la structure des vésicules à gaz (partie centrale cylindrique ou extrémités coniques ?). Les gènes gvpAorf1gvpN forment un opéron dont la transcription est segmentée et dépend du stade de croissance des cellules. Des recherches sont en cours pour tenter de synthétiser des vésicules à gaz chez les cyanobactéries qui n'en synthétisent pas naturellement et chez des cellules eucaryotes (en collaboration avec l'équipe de L. Edelman du Laboratoire de Technologie Cellulaire à l'Institut Pasteur).
La séquence du génome de Synechocystis PCC 6803, publiée en 1996, ayant révélé l'existence d'un gène phy présentant des analogies avec celui qui code pour les phytochromes chez les plantes, nous avons mis à profit notre collection de cyanobactéries pour étudier la distribution de ce gène chez vingt souches sélectionnées pour leurs caractéristiques physiologiques ou morphologiques. Après amplification (technique de "PCR") et séquençage de la région conservée correspondant à celle de l'attachement du chromophore, nous avons construit un arbre phylogénétique. Nos résultats confirment que le phytochrome des cyanobactéries est l'ancêtre des différents phytochromes des plantes.
En collaboration avec M. R. Schaefer (University of Missouri-Kansas City, USA), nous avons démontré que deux gènes de Calothrix PCC 7601 et SF33 codent pour les sous-unités d'une chromophore lyase requise pour l'attachement des chromophores PEB sur la sous-unité a de la phycoérythrine.
Au cours d'un stage dans notre équipe, P. Nomsawai, du laboratoire de M. Tantichaoren (King Mongkut's Institute of Technology Thonbury, Bangkok, Thaïlande), a montré que la régulation de la synthèse des phycobiliprotéines chez Arthrospira (Spirulina) platensis, cyanobactérie actuellement la plus utilisée pour des applications industrielles, s'effectue au niveau transcriptionnel et se traduit par une réduction de la taille des antennes photosynthétiques sous forte lumière. Ces travaux sont continués en Thaïlande.
(M. Herdman et R. Rippka-Herdmane)
La PCC (Pasteur Culture Collection), avec plus de 600 souches pures, est la plus importante au monde. Elle comprend également des souches de Prochlorales qui sont très proches des cyanobactéries d'un point de vue phylogénétique, mais qui synthétisent de la chlorophylle b, comme les plantes. Pour valoriser cette collection, il convient d'élargir notre connaissance des propriétés physiologiques et génétiques de l'ensemble des souches, en priorité de celles qui synthétisent des toxines qui peuvent être mortelles pour les animaux et/ou causer,chez l'Homme, des dermites ou des gastro-entérites, par exemple. Il est également important de développer des méthodes de repérage d'une espèce donnée dans son milieu naturel. Dans cette optique, un réseau européen a été établi avec neufautres laboratoires qui possèdent des compétences techniques complémentaires aux nôtres. Ce projet intitulé "Biodiversity: Applied and Systematic Investigations of Cyanobacteria" (BASIC), dont le coordinateur est M. Herdman, est financé pour trois ans par le programme "Biotechnology" de la Communauté Européenne.
Outre la caractérisation physiologique de souches appartenant aux genres Microcystis et Prochlorococcus, des analyses d'ARN ribosomiques 16S ont été réalisées permettant de préciser les relations phylogénétiques de ces souches et d'autres genres de cyanobactéries provenant d'écosystèmes très divers. Notre base de données d'ARN ribosomiques 16S contient à ce jour une centaine de séquences.
La base de données des propriétés des souches de la collection PCC est en évolution constante. Deux versions de la base sont désormais disponibles comme remplacement ou complément du catalogue : une version complète (logiciel Microsoft Access sous Windows 95) et une version "runtime" (logiciel de lecture Microsoft). Cette base de données est également accessible sur le Web, via le serveur de l'Institut Pasteur.
En collaboration avec L. Ordorika (Equipe de S. Puiseux-Dao et A. Couté, Laboratoire de Cryptogamie, C.E.M.A.T.M.A., Muséum d'Histoire Naturelle, Paris), nous avons isolé, purifié et identifié une trentaine de cyanobactéries dans le cadre d'un programme de recherche visant à déterminer les risques de pollution de divers sites de la région parisienne par des souches toxiques.
(R. Rippka-Herdman et N. Tandeau de Marsac)
L'Unité assure le maintien de l'ensemble des souches de la collection PCC qui sont mises à la disposition des laboratoires de recherche et des industriels dans le monde entier. Comme l'an dernier, des cours et des travaux pratiques sur la taxonomie et la conservation des cyanobactéries ont été organisés au King Mongkut's Institute of Technology Thonbury (Bangkok, Thaïlande).
(N. Tandeau de Marsac)
Un contrat de Recherche et Développement a été établi entre l'Institut Pasteur et le groupe Schneider-Electric, pour déterminer les capacités de dégradation des polychlorobiphényles, voire du pyralène, par des souches de cyanobactéries de la PCC. Le projet a commencé par une étude bibliographique approfondie faisant le point sur l'état des connaissances sur les polychlorobiphényles et leur dégradation. Des essais préliminaires de dégradation de polychlorobiphényles ont également été réalisés.