Toxines et Pathogénie Bactérienne - CNRS URA2172  


  RESPONSABLEProf. MOCK Michèle / mmock@pasteur.fr
  MEMBRESCOUTURE-TOSI Evelyne / DAVISON Sophie / Dr FOUET Agnès / Dr GLOMSKI Ian
Dr GOOSSENS Pierre / Prof. KOLSTO Anne-Brit / Dr MARY-POSSOT Odile / Dr MELONI Mauro
MOYA-NILGES Marie / Dr RANCK Jean-Luc / Dr SYLVESTRE Patricia
Dr VAN SCHAIK Willem

  Rapport d'activité

Bacillus anthracis est l'agent de la maladie du charbon. La virulence de B. anthracis nécessite simultanément la synthèse de deux toxines, létale et œdématogène, et la formation d'une capsule de polyglutamate. Les recherches portent sur : le rôle des toxines au cours de l'infection, leur mode d'action cellulaire, la contribution des structures de surface de la spore et de la bactérie dans l'interaction de ce pathogène avec l'hôte. Dans le domaine de la vaccination anti-charbonneuse, une composition vaccinale efficace, à usage humain, a été mise au point. Les mécanismes de protection impliqués sont analysés.

La spore est à la fois la forme de persistance de B. anthracis dans l’environnement et la forme infectante qui enclenche l’infection après germination dans l’hôte. L’enveloppe la plus externe de la spore de B. anthracis, l’exosporium, apparaît comme une structure chevelue. Sa face externe est constituée d’un ensemble de fins filaments prenant naissance à partir d’une couche basale présentant une organisation cristalline. La glycoprotéine BclA présentant une forte similitude avec les molécules de collagène mammifère est le composant structural des filaments présents à la surface de l’exosporium. La mise en place et/ou le maintien de BclA à la surface de la spore nécessite la présence de deux protéines, ExsFA et ExsFB. Ces protéines sont également impliquées dans le maintien de la stabilité du complexe cristallin de l’exosporium. Par une approche génétique similaire à celle utilisée pour la caractérisation des protéines ExsF, nous avons pu observer que deux autres protéines, CotY et ExsY sont nécessaires pour un assemblage correct de l’exosporium et du manteau. La caractérisation d’autres composants structuraux de l’exosporium et/ou du manteau ainsi que des protéines participant à la mise en place de ces composants est en cours.

Métabolisme et biodiversité chez B. anthracis :

Le charbon animal existe toujours en France où il apparaît, chaque année, de façon sporadique dans diverses régions. Les souches françaises de B. anthracis appartiennent aux deux grands groupes A et B de la classification mondiale incluant plus de 80 génotypes. Les génotypes GT79 et GT80 appartiennent au sous-groupe B2 et sont dominants en France mais rares dans le reste du monde. Les souches françaises du groupe B2 présentent des profils particuliers de fermentation des sucres. A l’inverse des souches du groupe A1, elles ne fermentent pas l’amidon et le glycogène mais sont capables d’utiliser le gluconate. Par ailleurs chez les souches du groupe B2, la glycoprotéine BclA présente un profil comportant plusieurs bandes glycosylées. Des expériences d’échanges de gènes ont montré que le phénotype de glycosylation de BclA est lié au fond génétique de ces souches. L’analyse génomique comparative des souches de B. anthracis appartenant aux groupes A et B a permis d’identifier différentes mutations ponctuelles pouvant affecter des activités dans les voies métaboliques de dégradation des sucres et dans les étapes de glycosylation de BclA. Une analyse fonctionnelle des facteurs ainsi identifiés est en cours à la fois par approche génétique et biochimique.

La surface du bacille :

La capsule a un rôle antiphagocytaire et recouvre une couche structurée formant un réseau, appelée couche S. Quatre protéines dont les gènes sont organisés en opéron, interviennent dans la synthèse de la capsule ; l’une, nouvellement découverte, est un peptide de 47 acides aminés qui a un rôle structural. Une cinquième protéine, dont le gène fait aussi partie de cet opéron, catalyse l'ancrage covalent et direct de la capsule au peptidoglycane.

Un mécanisme d’ancrage de protéines de surface a été décrit dans de nombreux pathogènes à Gram+. Des “sortases” catalysent l’ancrage covalent de protéines, portant le motif LPXTG, au peptidoglycane. Ce mécanisme existe chez B. anthracis qui possède trois sortases et probablement 14 protéines “LPXTG”. Le répertoire de chacune des sortases est en cours d’étude par des approches génétiques et biochimiques. En effet, la sortase A ancre la majorité des protéines “LPXTG”, alors que les deux autres sortases ancrent fréquemment des protéines ayant des rôles spécifiques liés à des situations environnementales particulières. Nous avons construit des mutants pour chacune des trois sortases. Nous avons identifié GamR, récepteur du phage gamma et montré qu’il s’agit d’une protéine “LPXTG”, ancrée par la sortase A. Des protéines chimères ont été construites entre la portion “récepteur phagique” de GamR et chacune des treize autres “queues LPXTG” constituées des motifs LPXTG suivis des régions hydrophobes. Par analyse de leur localisation dans chacun des mutants de sortase, nous définirons les répertoires de celles-ci.

Régulation des facteurs de virulence :

La synthèse des composants des toxines est maximale lors de l’entrée des bactéries en phase stationnaire. Des régulateurs impliqués dans des transitions de phase ont été décrits chez d’autres bactéries à Gram+. Parmi eux, CodY intervient dans l’expression de facteurs de virulence. Son rôle dans la régulation de la synthèse de la toxine et du régulateur central qu’est AtxA vient d’être montré. Une éventuelle intervention sur d’autres synthèses ainsi que le mécanisme impliqué pour chaque gène concerné vont être étudiés. Dans ce cadre, la réponse stringente est analysée. En effet, CodY possède des co-régulateurs dont le GTP, dont la concentration intracellulaire est abaissée lors de cette réponse. L’induction de la réponse stringente a conduit à l’arrêt de la synthèse des ARN stables et à l’apparition de ppGpp. Ces deux phénomènes sont abolis dans un mutant rel. Ceci indique que chez B. anthracis un seul gène, rel, est responsable de cette réponse. La régulation de la synthèse des composants des toxines et du régulateur AtxA dans un mutant rel et dans le double mutant rel-codY va être étudiée.

Modèles animaux :

Un modèle d’infection cutanée chez la souris a été développé, désormais combiné à l’utilisation de bactéries bioluminescentes. Cette approche permet de caractériser, d’une part l’infection, localement, au niveau du site infecté, et d’autre part les mécanismes de dissémination à distance vers le/les ganglion(s) drainant(s) et dans l’organisme en son entier. La comparaison de ces événements chez l’hôte naïf et chez l’hôte immunisé nous permet de poser des hypothèses précises sur les mécanismes immunitaires, innés et adaptatifs, pouvant être mis en œuvre pour contrôler l’infection. L'étude des voies d'infection inhalatoire et digestive est en cours de développement.

Immunité innée :

L’étude des mécanismes de l’immunité innée qui pourraient intervenir dans le contrôle précoce de la germination et de la dissémination de B. anthracis est poursuivie. Nous avons montré que la phospholipase A2 de type IIA, sécrétée par les macrophages alvéolaires et les neutrophiles, exerce une activité bactéricide vis-à-vis de B. anthracis, que ce soit sur les spores germées ou sur les bacilles capsulés. Son expression ou administration in vivo protège contre l'infection expérimentale murine par B. anthracis. Par ailleurs, nous analysons in vitro et in vivo les interactions entre les spores de B. anthracis et les cellules du système immunitaire, par exemple les cellules dendritiques (travail conjoint IP/ CRSSA) et les splénocytes. En particulier, nous étudions le rôle respectif de chaque toxine produite au cours de l'infection sur le profil de sécrétion des cytokines et chemokines ainsi que sur les cascades de signalisation intracellulaire, grâce à l'utilisation de différentes souches mutantes dans les facteurs de virulence. Nous avons ainsi montré l'importance de Myd88 dans la reconnaissance des spores par les macrophages et le rôle des cellules NK dans la sécrétion d'IFN-gamma.

Immunité adaptative :

Par ailleurs, nous développons un projet d’amélioration du vaccin à usage humain. En effet, l’efficacité du seul vaccin existant, basé sur l’immunité envers l’antigène protecteur PA, composant des toxines, est peu satisfaisante. Notre travail montre que l’adjonction de spores inactivées à PA augmente considérablement l’efficacité protectrice de ce vaccin, la rapprochant de celle du vaccin vivant. D’après les tests d’efficacité déjà réalisés sur modèles animaux, cette formule vaccinale offre des perspectives pour l’amélioration de la vaccination humaine. En collaboration avec le CRSSA, un modèle d’infection par aérosol et par voie intranasale a été mis en place pour étudier l’efficacité de la vaccination sur une infection par voie respiratoire, ceci dans le cadre de la lutte contre le bioterrorisme.

L’analyse des mécanismes de protection induits par ce protocole de vaccination a ainsi démontré que la réponse immunitaire dirigée contre les spores est une réponse cellulaire médiée par des lymphocytes T CD4 spécifiques et que l'interféron gamma est nécessaire à la protection induite.

mock.jpg



  Publications de l'unité

Toutes les publications 2006 sur notre base de données




Rapports d'activité 2006 - Institut Pasteur
En cas de problèmes, de remarques, ou de questions concernant cette page Web écrire à rescom@pasteur.fr