Régulation Enzymatique des Activités Cellulaires - CNRS URA2185  


  RESPONSABLEProf. VERON Michel / mveron@pasteur.fr
  MEMBRESDr AGOU Fabrice / CHIARAVALLI Jeanne / Dr FONTAN Elisabeth / Dr GALETTO Roman
Dr GRUBISHA Olivera / Dr KAMINSKA Monika / Dr NEGRONI Matteo / Dr RAMIREZ Berta Cecilia
SIMON-LORIERE Etienne / TRAINCARD François

  Rapport d'activité

Le laboratoire est formé de deux sous-groupes, dirigés chacun par un chercheur permanent.

La protéine NEMO, un élément régulateur essentiel de la voie de signalisation de NF-kB (Fabrice Agou).

La voie de transduction du signal NF-κB, d’abord impliquée dans les réponses immunitaires innées et adaptatives, intervient dans la réponse cellulaire à de très nombreux signaux. En particulier, son rôle dans l’apoptose est maintenant établi. Ainsi des inhibiteurs de la voie par leur effet pro-apoptotique potentiel sont candidats à être des agents anti-cancéreux. En combinant les méthodes de biochimie structurale in vitro et les approches de biologie cellulaire, nous étudions NEMO (NF-κB essential Regulator), une protéine « d’échafaudage » essentielle à l’activation des protéines kinases du complexe IKK qui joue un rôle central dans la régulation de la voie.

L’association de NEMO en trimères est nécessaire à son activité biologique et nous avons identifié un « domaine minimal d’oligomérisation » de la protéine formé par l’association de 6 hélices en « fuseaux torsadés » arrangés de manière anti-parallèle. Un peptide synthétique correspondant à l’hélice LZ (voir Figure) inhibe fortement et spécifiquement l’activation de la voie (IC50 = 3 μM) mesurée sur des cellules en culture (Collaboration F. Baleux, Unité de Chimie Organique). Ce même peptide induit spécifiquement l’apoptose chez des cellules malignes isolées de patients atteints de myélome. Ces résultats fournissent la « preuve de concept » pour la recherche de molécules ayant la capacité de stimuler spécifiquement l’apoptose de cellules cancéreuses via l’inhibition de l’oligomérisation de NEMO.

En utilisant les techniques de centrifugation en gradient de glycérol et de FRET, nous avons montré que le complexe IKK correspond à une association dynamique de ses divers composants, et que la stimulation de la voie NF-κB a pour conséquence l’oligomérisation et le recrutement de dimères NEMO - protéines kinases dans un complexe de haut poids moléculaire.

Il a été récemment montré que NEMO était capable de se fixer aux chaines de polyubiquitine liées entre-elles par une liaison isopeptidique sur la Lys63, et que cette fonction était impliquée dans la régulation de la voie. Nous avons identifié le site de fixation qui se situe au sein du domaine d’oligomérisation, ce qui suggère un lien fonctionnel entre oligomérisation et fixation à des protéines K63 polyubiquitinées dans l’activation du complexe IKK.

La protéine NEMO est également impliquée dans plusieurs maladies génétiques humaines rares, et notamment dans EDA-ID, une maladie dermatologique associée à une immunodéficience. Les protéines recombinantes mutantes correspondant à des mutations dans le domaine d’oligomérisation identifiées chez plusieurs patients ont été produites et purifiées. Leur caractérisation biochimique indique une perte de stabilité de l’édifice oligomérique, ce qui montre à nouveau l’importance de cette structure trimérique pour la fonctionalité de la protéine.

Etude du mécanisme de recombinaison chez les rétrovirus (Matteo Negroni).

Parmi les virus qui utilisent l’ARN pour stocker leur information génétique, les rétrovirus sont les mieux caractérisés, principalement grâce aux recherches menées ces vingt dernières années sur le virus de l’immunodéficience humaine (VIH). Une caractéristique particulière de ce virus est l’impressionnante diversité génétique des formes infectieuses disséminées à travers le monde. Une source majeure de cette diversité est la recombinaison qui, chez les rétrovirus, est la conséquence d’un changement de matrice par la reverse transcriptase lors de la transcription inverse, entre les deux copies d’ARN génomique présentes dans la particule virale. Ce phénomène est connu sous le nom de "copy choice" et, si les deux copies d’ARN génomiques sont différentes, il en résulte une recombinaison génétique. En réarrangeant de grandes portions du génome, le "copy choice" peut associer sur une même molécule de multiples mutations, augmentant ainsi considérablement la complexité génétique de la population virale. En plus d'accélérer la génération de souches résistantes en réponse à un traitement antiviral, on pense que la variabilité génétique permet au virus d’échapper au contrôle immunitaire de l’hôte. Nous nous sommes intéressés à l'étude du mécanisme de recombinaison et à ses conséquences sur l'évolution virale.

En utilisant un système reconstitué in vitro avec des éléments purifiés, nous avons montré que, contrairement à l’opinion couramment admise, l’échange de brins n’était pas principalement lié aux pauses de la transcriptase inverse pendant la reverse transcription, mais qu’il était fréquemment induit par la structure secondaire de l’ARN accepteur. Sur la base de ces résultats, nous avons proposé un modèle moléculaire selon lequel la recombinaison dans des régions structurées du génome ressemblerait à la migration de branche au cours de la recombinaison ADN-ADN. Nous avons ensuite développé un système original où l'infection de cellules en culture est limitée à un seul cycle infectieux. En permettant de caractériser les produits de recombinaison générés en absence de toute sélection, ce système nous donne accès aux produits de recombinaison générés par le mécanisme en soi. Nous avons ainsi confirmé que le mécanisme de recombinaison proposé in vitro était également valide in cellula.

Récemment, le taux de recombinaison dans le gène env entre isolats primaires de plusieurs sous-types du groupe M du VIH-1 a été analysé en utilisant ce système cellulaire. Les résultats montrent que le taux de recombinaison varie très fortement tout au long du gène, ce qui permet de définir les contraintes locales de séquence qui permettent à des souches divergentes de recombiner dans une région donnée du génome. L'impact de la génération de ces formes recombinantes sur l'évolution du virus est actuellement à l'étude.

Mots-clés: Transduction du signal,NF-kappaB, NEMO, apoptose, FRET, variabilité génétique, rétrovirus

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Domaine minimal d’oligomérisation de NEMO



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