Polarité et Migration cellulaires - CNRS URA2592  


  RESPONSABLEDr ETIENNE-MANNEVILLE Sandrine / setienne@pasteur.fr
  MEMBRESDr CAMAND Emeline / Dr MZALI Rym / OSMANI Naël / VALLOIS Isabelle

  Rapport d'activité

La migration cellulaire joue un rôle fondamental au cours du développement ainsi que chez l’adulte où elle participe à l’acheminement des cellules immunitaires vers les sites d’infection ou à la cicatrisation tissulaire. La migration des cellules tumorales contribue de manière importante à leur dissémination et aux métastases.

Notre but est de comprendre comment les cellules migrent et quels sont les éléments de leur environnement qui contrôle cette migration. Nous nous interessons plus particulièrement à l’initiation et à l’arrêt de la migration. La migration débute par la mise en place d’un axe de polarité des cellules, ce qui correspond à la réorganisation de l’architecture cellulaire suivant la direction de la migration. Lorsque les cellules s’arrètent de migrer, elles retrouvent leur organisation initiale et donc perdent leur polarité.

Nous cherchons à :

  • déterminer le rôle de l’interaction des cellules avec le substrat et avec les cellules voisines dans le contrôle de la polarité et de la migration cellulaire.

  • explorer les mécanismes intracellulaires contrôlant la mise en place de la polarité cellulaire et en particulier l’organisation du cytosquelette et du trafic membranaire

Nous étudions plus particulièrement certaines cellules essentielles du système nerveux que sont les astrocytes. Les astrocytes constituent une grande majorité des cellules gliales et contribuent de manière importante à la différentiation, le développement et le fonctionnement des neurones. Au cours des lésions cérébrales, les astrocytes participent à la formation de la cicatrice gliale qui limite la régénération axonale. Les astrocytes peuvent donner naissance à des gliomes, tumeurs cérébrales extrèmement invasives et particulièrement difficiles à traitées.

Nos travaux devraient permettre de mieux connaître les mécanismes moléculaires fondamentaux qui contrôlent la polarisation et migration cellulaires. Nous espérons aussi déterminer précisemment les conditions de la migration astrocytaire et analyser, pour essayer de corriger, les dérèglements observés lors de la migration des cellules de gliomes.

Les principaux résultats obtenus au cours de l’année 2006.

A- Régulation de la polarisation astrocytaire par le contact avec la matrice extracellulaire : rôle de Scrib et βPIX

Scrib est l’orthologue de la protéine Scribble de Drosophile. Chez la Drosophile, Scribble est un gène suppresseur de tumeur impliqué dans le contrôle de la polarité dans les cellules épithéliales. Scrib est une protéine adaptatrice qui comprend des motifs répétés riches en leucine (domaine LRR), une région central sans domaine identifiables, 4 domaines d’interactions PDZ qui permettent en particulier la liaison de βPIX, une facteur d’échange pour les petites protéines G, et domaine carboxy-terminal encore non charactérisé. Nous avons étudié le rôle de Scrib au cours de la polarisation d’astrocytes primaires dans un modèle in vitro de migration orientée en réponse à une rayure dans la monocouche cellulaire (Figure 2).

Grâce à des approches d’interférence ARN et d’expression de formes tronquées ou mutées, nous avons montré que la protéine Scrib joue un rôle essentiel dans les étapes très précoces de la polarisation et de la migration astrocytaire. Scrib est nécessaire au positionnement correct du centrosome et de l’appareil de Golgi et à la formation des protrusions astrocytaires en direction de la migration. Scrib est donc essentiel à la migration orientée des astrocytes. Nous avons montré qu’au cours de la polarisation cellulaire, Scrib est recruté à la membrane plasmique avant.

Nous avons mis en évidence biochimiquement et par immunofluorescence que Scrib interagit avec βPIX à l’avant des cellules en migration. La perturbation par différentes constructions Scrib ou βPIX de l’interaction entre les deux protéines abolit le recrutement de βPIX à la membrane plasmique avant et inhibe la polarisation astrocytaire. Enfin, nous avons démontré que les protéines Scrib et βPIX sont toutes deux nécessaires à l’activation et au recrutement de la petite protéine G Cdc42 à l’avant des cellules. Ainsi, l’activité et la localisation de Scrib et βPIX, comme celle de Cdc42 sont nécessaires à la polarisation et à la migration des astrocytes.

B- APC, Dlg et la régulation du réseau de microtubules dans les astrocytes en migration

APC est un suppresseur de tumeur qui est impliqué dans la polarisation astrocytaire. APC est recruté à l’extrémité ‘plus’ des microtubules à l’avant des cellules en migration via une voie de signalisation impliquant les protéines Cdc42, Par6, PKC et GSK3β(Figure 3). APC interagit avec les protéines EB1 située à l’extrémité des microtubules et Dlg1, située à la membrane plamique avant. L’analyse de l’organisation et de la dynamique des microtubules nous a permis de montrer que les protéines APC (Adenomatous Polyposis Coli) et Dlg, qui sont essentielles à la polarisation astrocytaire, régulent l’ancrage des microtubules à la membrane plasmique basale et contrôlent la dynamique des microtubules (Figure 3).

Nous avons mis au point des ARN interférent pour différentes sous unités de la dynéine et du complexe dynactine qui lui est associé sont nécessaires. Ceci nous a permis de mettre en évidence que comme APC et Dlg, la dynéine et la dynactine sont nécessaires à l’ancrage des microtubules au cortex cellulaire, à l’orientation du centrosome et de l’appareil de Golgi et à la migration polarisée des cellules.

Nous avons observé que la régulation d’APC est altérée dans des lignées de gliomes, ce qui pourrait rendre compte de l’orientation aléatoire de leur migration dans notre modèle in vitro. EB1 est correctement localisé dans ces cellules, ce qui nous poussent à penser que les voies de signalisation permettant le recrutement d’APC sont inactives dans les cellules tumorales. Nous cherchons donc maintenant à savoir à quel niveau ces voies de signalisation sont altérées.

C- Régulation et rôle de LKB1 au cours de la polarisation astrocytaire

LKB1 est une sérine/thréonine kinase, produit d’un gène suppresseur de tumeur impliqué dans le syndrome de Peutz-Jeghers. LKB1 interagit avec plusieurs protéines, et en particulier avec les protéine GSK3β, AGS3, Par3 et PTEN. LKB1, Par3 et AGS3 ont été également identifiées chez C. elegans (PAR-4, APR-1) où elles contrôlent la polarité du zygote au cours des divisions asymétriques. PTEN contrôle la polarité au cours de la chimiotactisme de D. discoideum.

L’inhibition de l’expression de LKB1 par interférence ARN nous a permis de démontrer le rôle de LKB1 dans la polarité astrocytaire ce qui confirme les résultats que nous avions précédemment obtenus avec des mutants catalyquement inactif de LKB1. LKB1 interagit avec AGS3 dans les astrocytes en migration. Et que AGS3 et les domaines d’interaction impliqués dans la liaison d’AGS3 à LKB1 sont nécéssaires à la polarisation astrocytaire.

En collaboration avec l’équipe de M. Billaud(Lyon), nous étudions aussi l’interaction de LKB1 avec GSK3βet son rôle dans la polarisation astrocytaire.

D- Influence des interactions cellulaires homologues et hétérologues sur la polarité astrocytaire

Les astrocytes interagissent entre eux grâce en particulier à des jonctions adhérentes mettant en jeu la N-cadhérine. De plus, ils sont aussi susceptibles d’interagir avec les neurones ou les autres cellules gliales avoisinantes (oligodendrocytes et microglies) qui expriment aussi la N-cadhérine. Dans certaines conditions (lésions cérébrales, tumeurs cérébrales etc…) les astrocytes peuvent rencontrer des cellules qui ne sont pas d’origine neurale, telle que les fibroblastes méningés ou les cellules endothéliales cérébrales, qui n’expriment pas la N-cadhérine. Nous avons établit de nouveaux modèles in vitro de façon à étudier l’influence des contacts cellulaires sur la polarisation astrocytaire.

Nous fabriquons des micropatrons adhésifs (en collaboration avec Dr M. Piel, Institut Curie, Paris) lui permettant de réaliser des micro patrons adhésifs de différente taille sur lesquel il est possible de faire adhérer une ou plusieurs cellules (Figure 4). Les astrocytes primaires sont transfectés de manière à exprimer différentes molécules couplées à la GFP (actine, tubuline, composants du centrosome, ou N-cadhérine). Il est ainsi possible de suivre par vidéomicroscopie l’étalement et l’organisation des éléments du cytosquelette, du centrosome et des jonctions cellulaires des astrocytes en fonction de la forme du patron adhésif et de la présence ou de l’absence de cellules voisines. Des résultats préliminaires montrent un effet très fort des jonctions cellulaires sur l’organisation polarisée des astrocytaires.

Grâce à la technique d’interférence ARN, nous inhibons l’expression de la N-cadhérine ainsi que des molécules qui lui sont associées telles que la β-caténine et la p120 caténine. La disparition de la N-cadhérine et des jonctions adhérentes entraîne une perte de la polarité astrocytaire au cours de la migration dans un modèle de rayure de la monocouche cellulaire. Comme la N-cadhérine est très peu exprimée dans les cellules tumorales, nous souhaitons tester si la réintroduction de la protéine de manière exogène permet de retrouver des conditions de migration normale avec ces cellules. Au cours de l’année à venir nous souhaitons développer des modèles de co-culture comprenant des astrocytes primaires et des cellules telles que les fibroblastes méningés ou les cellules endothéliales cérébrales qui n’expriment pas de N-cadhérines pour tester l’effet de ces contacts hétérologues sur le contrôle de la migratione et de la polarité astrocytaire.

Financement

Les travaux de notre laboratoire sont financés grâce à l’Institut Pasteur, au CNRS, à la Fondation de France, à l’ARC, à la FRM, à l’IRME et à la Ligue contre le Cancer.

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Figure 1 : Polarisation des astrocytes en migration. Les cellules sont visibles par microscopie à contraste de phase. Les images en immunofluorescence montrant le noyau (bleu), le centrosome (rouge) et l’appareil de Golgi (vert) sont été surimposées.
Figure 2 : Scrib est nécessaire à la polarisation des astrocytes en migration. Dans un modèle in vitro de migration induite par une rayure (ligne en pointillés), la polarisation astrocytes est caractérisée par le positionnement du centrosome (rouge) et de l’appareil de Golgi (jaune) en avant du noyau (bleu) des cellules. En absence de Scrib (siRNA Scrib1), l’orientation du centrosome et du Golgi par rapport au noyau est alléatoire.
Figure 3 : APC est localisé à l’extrémité des microtubules à l’avant des astrocytes en migration. APC (en rouge) est visible à l’extrémité des microtubules (en vert) à l’avant des astrocytes en migration. L’image de gauche est une image en épifluorescence. Les deux images de droite montre APC à l’extrémité des microtubules ancrés à la membranes plasmique basal grâce à la microscopie à onde évanescente.
Figure 4 : Astrocyte sur des micropatrons adhésifs. Les cellules ont été déposées sur des micropatrons adhésifs de différentes formes. Le cytosquelette (microtubules en vert, noyau en bleu et centrosome en rouge) est organisé en fonction de la forme adhésive imposée aux cellules.



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