Neuro-immunologie Virale


  RESPONSABLEDr LAFON Monique / mlafon@pasteur.fr
  MEMBRESMEGID Jane / MEGRET Françoise / MENAGER Pauline / Dr PREHAUD Christophe / WAUQIER Nadia

  Rapport d'activité

Le thème de recherche du laboratoire consiste à étudier comment certains virus neurotropes favorisent la survie des neurones et paralysent la réponse immunitaire. L’étude des bases moléculaires des mécanismes mis en jeu et l’identification de facteurs viraux neuroprotecteurs devraient permettre de développer des stratégies thérapeutiques neuroprotectrices.

La plupart des infections virales induisent la destruction des cellules infectées et sont éliminées par le système immunitaire. Cependant, certains virus ont élaboré des stratégies qui leur permettent d’échapper à la réponse de l’hôte. C’est le cas du virus de la rage et dans une moindre mesure de celui de l’herpes.

Le virus de la rage est un virus neurotrope qui induit une encéphalomyélite d’issue toujours fatale. L’Homme est contaminé par morsure d’animal enragé, le plus souvent celle d’un chien mais aussi de chauve-souris. La rage reste un grave problème de santé publique dans plusieurs régions du globe, au premier chef l’Asie où la recrudescence récente des cas de rage est spectaculaire. Après son inoculation par morsure au niveau d’un muscle, le virus de la rage entre dans le système nerveux (SN) où il se propage en infectant exclusivement les neurones avant d’être excrété au niveau des glandes salivaires et pouvoir contaminer un nouvel hôte. Paradoxalement, malgré sa forte pathogénicité, le virus de la rage n’induit pas la mort des neurones et la réponse immunitaire qu’il génère ne parvient pas à entraver sa progression au travers du SN. La préservation de l’intégrité des neurones qu’il infecte et l’échappement à la réponse immune assurent avec succès son cheminement au travers du SN et sa transmission à un nouvel hôte.

Le virus de l’Herpes Simplex de type 1 (HSV-1)est un virus neurotrope qui après une phase d’infection aiguë des neurones sensoriels entre en état de latence sous la pression du système immunitaire. Il n’échappe donc pas entièrement à la réponse immune. Le HSV-1 peut, sous certaines conditions, être réactivé (bouton de fièvre) et infecter un nouvel individu. Il peut aussi infecter le SN et induire une encéphalite sévère.

A- Les modèles viraux et cellulaires

La pathologie du virus de la rage pour le SN est étudiée dans un modèle d’infection du SN de la souris à l’aide de souches de virus de rage adaptées à la souris. Les études sur HSV-1 sont exclusivement réalisées in vitro. La souche de HSV-1 utilisée (KOS) est une souche inductrice in vitro d’une infection latente.

Nous disposons de souches de virus de rage de pathogénicité différente : des souches de virus de rage qui induisent la survie des neurones et déclenchent chez la souris une encéphalomyélite aiguë mortelle et des souches qui, au contraire, induisent la destruction des neurones par apoptose mais n’infectent plus le SN.

Les analyses in vitro sont réalisées sur des cultures de neurones humains post-mitotiques (NT2-N) (PHOTO1) différenciées à partir du clone 2D1 de tératocarcinome humain NTera-2(Pleasure, 1992) par traitement séquentiel à l’acide rétinoïque et d’inhibiteur de mitose (Cheung et al, 1999). Des variations dans le protocole de différenciation permettent d’obtenir aussi à partir de ce clone, soit des cultures pures de astrocytes (NT2-A) soit des cultures mixtes neurones /astrocytes (NT2-N/A) (Sandhu et al, 2002).

B- Immunosubversion et infection du SN par des virus neuronotropes

B-1 Réponse immune adaptative

Une des stratégies immuno-évasives du virus de la rage repose sur la surexpression de molécules immunosubversives -comme FasL- qui permettent de détruire les lymphocytes supposés combattre l’infection dans le système nerveux. Nous avons cherché à savoir si en plus de FasL, le virus de la rage utilisait d’autres molécules immunosubversives comme celles du complexe majeur d’histocompatibilité de classe I non classique HLA-G ou HLA-E.

HLA-G jouerait un rôle dans l’établissement de la tolérance en protégeant les cellules cibles, comme les cellules tumorales ou cellules fœtales semi-allogéniques de l’attaque des cellules NK (natural Killer) et des cellules cytotoxiques CD8+ (Carosella E, et al, 2000). L’expression de HLA-E à la membrane protégerait les cellules ayant perdu l’expression des molécules du CMH de classe I classique de l’attaque par les cellules NK (Tomasec et al, 2000). Pour que les molécules HLA-G et HLA-E puissent jouer leur rôle de bouclier contre la réponse de l’hôte elles doivent être exprimées à la surface de la cellule.

La sur-expression des molécules HLA-G et celles d’HLA-E au cours de l’infection par le virus de la rage ont été mises en évidence in vitro, au niveau transcriptionnel et protéique, dans un modèle de cultures de neurones post-mitotiques humains NT2-N, et dans des cultures de neuroblastomes humains. Seules les molécules de HLA-G sont détectables à la surface des neurones. Le virus de la rage stimule l’expression de HLA-G aussi bien dans les neurones infectés (effet cis) que dans les cellules non infectées situées à proximité (effet trans), en particulier dans les astrocytes des cultures mixtes neurones/astrocytes (NT2-N/A). Ceci suggère que la molécule HLA-G pourrait participer à l’établissement dans le SN infecté d’un environnement hostile aux lymphocytes et aux cellules NK au cours de l’infection du SN (Schéma). Par contre, HLA-E dont l’expression au cours de l’infection par le virus de la rage est accrue mais reste cytoplasmique, ne contribuerait pas à la stratégie immunosubversive du virus de la rage.

Au cours de l’infection par une souche latente de HSV-1, l’expression de HLA-G est augmentée, mais les molécules de HLA-G n’atteignent pas la surface des neurones infectés, suggérant qu’au cours d’une infection latente par HSV-1, les neurones infectés n’échappent pas, tout du moins par ce mécanisme, à la surveillance immunitaire de l’hôte

Ce travail a été réalisé en collaboration avec Nathalie Rouas-Freiss et Philippe Moreau de l’Unité d’Immuno-Hématologie CEA/Hôpital Saint-Louis, dirigée par le Pr Edgardo Carosella.

Articles du laboratoire sur le sujet : Lafon M et al, 2005, Mégret F et al, 2007, Lafon M 2004, Baloul L et al, 2004.

B-2 Réponse immune innée

L’infection par un virus déclenche, dès les premières heures de l’infection, une réponse non spécifique de l’hôte appelée réponse immunitaire innée. Elle consiste en la production d’interféron de type 1, de molécules cytoattractives (chimiokines), cytokines inflammatoires et de molécules antivirales. Cette réponse résulte de la reconnaissance de motifs microbiens par des récepteurs cellulaires de type Toll Like receptors (TLR) ou RIG like receptors (RLR) présents à la membrane des cellules, le cytoplasme ou les endosomes.

Dans le parenchyme nerveux, il était admis que seules les cellules gliales et tout particulièrement la microglie, étaient les cellules réactives du SN. Néanmoins, nous avions observé que les neurones humains de patients ayant succombé à une infection rabique ou à des maladies neurodégénératives caractérisées par une forte composante inflammatoire (Alzheimer , ALS) exprimaient en grande quantité un des TLR impliqués dans la réponse immune antivirale, le TLR3. Nous avons donc cherché à savoir si, dans le cas d’une l’infection du SN où seuls les neurones sont infectés comme dans la rage, les neurones pouvaient déclencher une réponse immune innée.

La comparaison des transcriptomes (biopuces humaines Affymetrix) doublées par des expériences de PCR et d’immunochimie de neurones humains post-mitotiques infectés par le virus de la rage, par HSV-1 ou non infectés (situation contrôle) nous a permis de montrer que les neurones avaient bien la capacité intrinsèque de détecter une infection virale et de déclencher une réponse immune innée caractéristique avec production d’interféron, de chimiokines, cytokines, et molécules antivirales. Néanmoins, l’intensité de la réponse dépendait de la nature du virus, puisque la transcription d’un grand nombre de gènes était stimulée au cours de l’infection par le virus de la rage alors qu’elle était limitée en intensité et en durée après infection par le HSV-1. HSV-1 en particulier ne déclenchait pas de réponse interféron dans les neurones. La plupart des virus ont mis au point des mécanismes leur permettant d’échapper à la réponse immune. Cela semble bien être le cas du virus HSV-1 qui bloque des les premières heures la réponse immune innée du neurone. Pour le virus de la rage ce contrôle ne semble intervenir que tardivement et reste modéré. L’infection du SN de la souris par le virus de la rage déclenche une forte réponse immune innée caractérisée par la production de cytokines et chimiokines et la surexpression des récepteurs à chimiokines. Néanmoins, ni le complément, ni l’IFN-β ne s’opposent significativement à la propagation du virus dans le SN (Hooper G et al, 1998). Il semblerait même que le virus tire avantage de l’inflammation qu’il provoque. Nous avons en effet montré in vivo, en comparant la pathologie rabique de souris invalidées pour le récepteur de type 1 au TNF-α(P55TNFR) que l’absence de ce type de récepteur au TNF-αretardait la propagation du virus dans le SN. Ceci suggère que paradoxalement, l’inflammation dans certaines conditions pourrait favoriser la propagation de l’infection virale.

Articles du laboratoire sur ce sujet : Lafon M et al, 2006, Jackson AC et al, 2006, Prehaud C 2005, Lafon M 2004, Baloul L et al, 2004, Baloul L et Lafon M , 2003, Camelo S et al, 2001.

C- Neuroinvasion et neuroprotection

Le virus de la rage neurotrope n’induit pas la destruction par apoptose des cellules qu’il infecte mais au contraire induit sa survie en activant des voies de signalisation de survie neuronale. Ceci pourrait résulter de la nécessité pour ce virus de protéger l’intégrité du réseau neuronal qui assure son transport au travers du SN depuis le site d’inoculation, le muscle jusqu’à l’encéphale et les glandes salivaires d’où il est excrété.

Des souches mutantes du virus de la rage ayant perdu leur neurotropisme induisent au contraire l’apoptose et n’activent plus les voies de survie neuronale. La pathogénicité du virus de la rage est inversement proportionnelle à sa capacité à induire l’apoptose. La glycoprotéine semble jouer un rôle pivot dans ce contrôle comme l’ont montré des expériences de sur-expression de la glycoprotéine ou l’utilisation de virus chimères. Nous avons mis en évidence que l’apoptose ou l’absence d’apoptose dépendait de l’origine de la glycoprotéine et de la manière dont cette protéine s’accumulait à la membrane plasmique.

En effectuant un crible à très haut débit par double hybride à partir d’une banque de cerveau humain, nous avons identifié des protéines neuronales interagissant différentiellement avec les parties cytoplasmiques de la glycoprotéine. Ceci nous a conduit à émettre l’hypothèse que dans le neurone, les glycoprotéines inductrices d’apoptose ou de survie pourraient activer des voies de signalisation cellulaires différentes et engager la cellule infectée sur la voie de l’apoptose ou de la survie.

La caractérisation de ces voies et les mécanismes impliqués est en cours d’analyse dans le cadre d’une étude structure/fonction alliant des approches de biologie cellulaire, biochimie et de biophysique ainsi que de génétique virale. Ce programme est réalisé en collaboration avec Nicolas Wolff et Karine Wecker de l’Unité de Résonance Magnétique Nucléaire des Biomolécules dirigée par Muriel Delepierre.

Articles du laboratoire sur le sujet : Thoulouze M-I et al, 1997, 2003a, 2003b, Préhaud C et al, 2003, Lay S et al, 2003.

Mots-clés: neurones, virus de la rage, HSV-1, TLR-3, HLA-G, HLA-E, FasL, apoptose, survie neuronale

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Neurons from the cerebellum of a human rabies case express TLR3 (brown staining)



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