Mycologie Moléculaire - CNRS FRE2849  


  RESPONSABLEDr DROMER Françoise / dromer@pasteur.fr
  MEMBRESProf. BRETAGNE Stéphane / Dr CHARLIER Caroline / Dr DANNAOUI Eric / DESNOS-OLLIVIER Marie
Dr FSIHI Hafida / Prof. GANTIER Jean-Charles / GARCIA-HERMOSO Dea / Dr JANBON Guilhem
LEE Nancy / Prof. LORTHOLARY Olivier / Dr MEMET Sylvie / RIERA-BONET Marta / SCHWARZ Patrick

  Rapport d'activité

Une meilleure connaissance de l'interaction entre l'hôte et les champignons pathogènes pourrait améliorer le pronostic des mycoses systémiques. Nous centrons nos recherches sur la pathogénicité de Cryptococcus neoformans et de Candida albicans par une approche simultanée de l’hôte (études cliniques et épidémiologiques, modèles animaux) et du pathogène (facteurs de virulence, variabilité).

Cryptococcus neoformans

C. neoformans est une levure basidiomycète capsulée qui provoque des méningo-encéphalites de pronostic sévère malgré les traitements antifongiques, avec une mortalité précoce de l'ordre de 20 %. Ceci justifie la recherche de mesures thérapeutiques ou prophylactiques nouvelles. Cette infection opportuniste touche jusqu'à 30 % des patients infectés par le virus de l’immunodéficience humaine dans certains pays d'Afrique et d'Asie du Sud Est. L’étude de la physiopathologie des cryptococcoses et des mécanismes de virulence de C. neoformans représente à terme les meilleurs moyens d’améliorer la prise en charge des patients atteints de cryptococcose.

Etude de la capsule de C. neoformans (G. Janbon, N. Lee, F. Moyrand)

Chaque cellule de C. neoformans est entourée d’une capsule polysaccharidique qui représente le facteur de virulence principal. Ainsi, les souches acapsulées sont avirulentes et la capsule a un effet délétère sur la réponse immunitaire. L’utilisation d’anticorps monoclonaux spécifiques nous a permis d’observer une grande variabilité de structure d’une cellule à l’autre au sein d’une même population cellulaire. Notre hypothèse de travail est que la variabilité de la structure de la capsule est, au moins pour une part, responsable de la virulence de C. neoformans. Nous avons cloné des gènes codant pour divers éléments de la voie de biosynthèse du polysaccharide capsulaire. Un programme de disruption systématique des gènes potentiellement impliqués dans la synthèse des polysaccharides capsulaires est en cours et nous avons d’ores et déjà construit plus de 60 souches mutantes. Ces souches sont non seulement utilisées pour étudier l’influence de la structure de la capsule sur la physiopathologie de la cryptococcose mais aussi, pour l’étude plus fondamentale des voies de biosynthèse des polysaccharides chez les eucaryotes (régulation du transport de nucléotides-sucres dans l’appareil de Golgi et le réticulum endoplasmique, influence de l’épissage de certains gènes sur la structure de la capsule…). En effet, C. neoformans peut être considéré à de nombreux égards comme un très bon modèle pour l’étude de la biosynthèse des polysaccharides chez les eucaryotes supérieurs.

Etude du franchissement de la barrière hémato-encéphalique (BHE) par C. neoformans (C. Charlier, F. Dromer)

Les mécanismes de franchissement de la BHE par C. neoformans sont encore mal connus. En collaboration avec Fabrice Chrétien (INSERM EMI 0011, Hôpital H. Mondor, Créteil), nous avons entrepris d'étudier le rôle des cellules mononucléées circulantes dans le franchissement de la barrière hémato-encéphalique grâce au modèle expérimental murin. Des analyses par immuno-histochimie, cytométrie de flux et microscopie confocale sont utilisées pour étudier le type cellulaire. Des modèles cellulaires sont également mis au point au laboratoire pour étudier plus précisément les interactions entre C. neoformans et les cellules endothéliales d'une part, et les monocytes d'autre part.

Etude de la réponse de l’hôte à l’infection du SNC par C. neoformans (S. Mémet)

Peu de données existent quant au rôle des cellules de l’hôte, endothéliales et gliales notamment, sur le franchissement de la barrière hémato-encéphalique (BHE), la dissémination de C. neoformans, ainsi que sur l’induction/répression de la réponse inflammatoire. Nous avons donc initié une analyse approfondie de la signalisation inflammatoire déclenchée par C. neoformans, avec un accent particulier sur le rôle du facteur de transcription NF-κB, un régulateur majeur de l’inflammation, et de l’immunité innée et acquise. Des expériences sont en cours avec deux champignons pathogènes, qui induisent une faible (C. neoformans) ou une très forte (C. albicans) réponse inflammatoire, C. neoformans étant responsable de méningo-encéphalites. La comparaison de l’impact de ces deux pathogènes devrait mettre en lumière les mécanismes moléculaires responsables des similarités et spécificités de ces deux champignons à initier une réponse immunitaire innée, et peut-être élucider les raisons de leur différence à franchir la BHE et à induire une méningo-encéphalite. Des résultats préliminaires menés avec un modèle humain de cellules endothéliales de la BHE, indiquent que bien que ces deux champignons activent NF-κB dans ces cellules, la cinétique d’activation est différente.

Candida albicans

Candida albicans, une levure ascomycète saprophyte du tube digestif, est le deuxième microorganisme étudié dans l’Unité de Mycologie Moléculaire. Cette levure est responsable d'infections sévères chez des patients immunodéprimés par des chimiothérapies aplasiantes, des transplantations d'organes ou de moelle osseuse, mais aussi d'infections nosocomiales dans des services de réanimation.

Etude de la formation de biofilms chez C. albicans et C. glabrata (G. Janbon, M. Riera)

Les biofilms sont des structures tri-dimensionnelles de micro-organismes qui se développent sur différents supports. En ce qui concerne les Candida, ces structures peuvent se développer sur les cathéters ou encore sur des prothèses et sont potentiellement sources de récidives après traitement antifongique. L’objectif de ce projet est de déterminer les mécanismes moléculaires de la formation de biofilms à Candida. Ce projet fait l’objet d’un PTR avec l’Unité Postulante Biologie et Pathogénicité fongiques, l’Unité de Chimie Organique, la plate forme Cristallogenèse et diffraction des rayons X et celle de Production de protéines recombinantes et anticorps).

Nous avons aussi cherché à identifier des gènes nécessaires à la formation des biofilms. Pour cela, nous avons utilisé Candida glabratacomme modèle. C. glabrata a en effet l’avantage non seulement d’être une levure pathogène deuxième, en terme de fréquence après C. albicans, mais aussi d’être un microorganisme haploïde ce qui permet de faire de la génétique. Nous avons sélectionné plus de 100 souches mutantes qui étaient, soit incapables de faire des biofilms (phénotype Biofilm-), soit qui formaient plus de biofilm que la souche originale (phénotype Biofilm++). L’identification de certains des gènes correspondant a permis d’identifier notamment une adhésine essentielle pour la formation des biofilms et de comprendre sa régulation. Nous avons pu en effet démontrer que le niveau de transcription de cette adhésine était régulé par le silencing télomérique, par un signal activé en condition de croissance biofilm et par la kinase Yak1p. Confirmant l’intérêt d’utiliser C. glabratacomme modèle, la kinase Yak1p est apparue nécessaire à la formation de biofilm par C. albicans.

Centre National de Référence Mycologie et Antifongiques (F. Dromer, O. Lortholary)

Les nouvelles missions du CNRMA sont très variées. Elles impliquent d'une part, une expertise dans le domaine de l'identification des levures et des champignons filamenteux pathogènes (D. Garcia-Hermoso, J.-C. Gantier, D. Raoux, D. Hoinard, M. Desnos), leur typage moléculaire (S. Bretagne, D. Garcia-Hermoso, M. Desnos), et les tests de sensibilité aux antifongiques, ainsi que dans la prise en charge des patients suspects ou atteints de mycoses sévères par le biais de conseils, et d'autre part, la surveillance épidémiologique des mycoses sévères, rares ou exotiques, et de la résistance aux antifongiques. Une surveillance active (l'Observatoire des Levures) a été mise en place pour surveiller ces infections en région parisienne et caractériser, au cours du temps, les espèces de levures responsables de fongémies (identification, typage, profil de sensibilité). Le serveur RESOMYC de déclaration en ligne est accessible depuis 2005 aux personnels de santé cliniciens et microbiologistes/mycologues impliqués dans la prise en charge des patients atteints de mycoses invasives.

Etudes épidémiologiques sur les infections fongiques systémiques (O. Lortholary, F. Dromer, S. Bretagne) 

Etude des endocardites fongiques : En collaboration avec Agnès Lefort (Médecine Interne, Hôpital Beaujon), nous menons la première étude prospective sur l'épidémiologie, la contribution des outils sérologiques et moléculaires pour le diagnostic et le pronostic de ces infections. Cette étude "MYCENDO" est promue par l'Institut Pasteur.

Etude de l'association amphotéricine B + 5-fluorocytosine sur les souches de C. neoformans sensibles ou résistantes à la 5FC (P. Schwarz, F. Dromer, O. Lortholary, E. Dannaoui)

Le traitement de première intention de la cryptococcose neuro-méningée repose actuellement sur l’association amphotéricine B + 5-fluorocytosine. Dans les cas où la souche de C. neoformans est résistante à la 5-fluorocytosine l’association n’est pas recommandée et pourrait même être délétère, même si les arguments disponibles pour défendre cette hypothèse sont peu nombreux. Pour ces raisons, l’association a été testée en parallèle sur des souches sensibles et résistantes à la 5-fluorocytosine. Un panel de souches résistantes possédant des mécanismes de résistances variées a ensuite été testé in vitro par différentes techniques, ce qui a permis de démontrer que l’association était soit synergique soit indifférente, mais jamais antagoniste. Ces résultats suggèrent que l’association amphotéricine B + 5-fluorocytosine peut être utilisée chez les patients même dans les cas où la souche est résistante à la 5-fluorocytosine.

Identification moléculaire des champignons pathogènes (D. Garcia-Hermoso, M. Desnos, S. Bretagne, J.-C. Gantier, O. Lortholary, F. Dromer)

L’identification des champignons repose actuellement sur les caractères culturaux macroscopiques et sur la morphologie observée en microscopie. Pour un certain nombre de groupes de champignons ces caractéristiques ne sont pas discriminantes pour une identification au niveau de l’espèce ou n’apparaissent que difficilement et tardivement après plusieurs semaines de culture pour certains champignons filamenteux. Le séquençage de l’ADN ribosomal (régions ITS1-5.8S-ITS2, et 26S) est systématiquement effectué pour tous les isolats correspondant à des espèces peu fréquentes, avec en parallèle caractérisation phénotypique complète et détermination de la sensibilité aux antifongiques systémiques. Cette approche systématique nous permet de construire une base de données combinant les données épidémiologiques, les caractères physiologiques, des images numériques et les données de séquences.

Diagnostic moléculaire des zygomycoses : Les zygomycètes sont responsables de pathologies extrêmement sévères (zygomycoses) survenant chez des patients immunodéprimés, chez des diabétiques mais aussi a la suite de traumatismes importants chez des patients immunocompétents. Une vingtaine d’espèces environ, appartenant à une dizaine de genres différents sont responsables d’infections chez l’homme. La mise au point d’une identification moléculaire ouvre comme perspective le diagnostic direct de ces champignons à partir des tissus infectés ce qui permettrait de s’affranchir de la culture qui est souvent négative au cours de ces infections. Une étude multicentrique européenne IDZYG est en cours



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