Membranes Bactériennes - CNRS URA2172  


  RESPONSABLEProf. WANDERSMAN Cécile / cwander@pasteur.fr
  MEMBRESBENEVIDES MATOS Najla / Dr BIVILLE Francis / CESCAU Sandra / Dr CHESNEAU Olivier
CWERMAN Hélène / Dr DASSA Elie / Dr DELEPELAIRE Philippe / Dr LETOFFE Sylvie / Dr NUNEZ SAMUDIO Virginia

  Rapport d'activité

L’analyse des séquences d’ADN a révélé que plus de la moitié des gènes bactériens codant pour des polypeptides n’avaient pas de fonction connue. De plus, de nombreux polypeptides peuvent avoir plusieurs fonctions.

En utilisant des approches génétiques, notre laboratoire s’efforce de découvrir de nouvelles fonctions. Nos travaux sur les hémophores, sur les protéines de membrane externe de la famille TolC, sur les perméases à hème et peptides, ont été et sont le point de départ de collaborations pour des études biochimiques et biophysiques de ces protéines que nous avons d’abord caractérisées génétiquement.

Transport de l’hème à travers la membrane externe. (Sylvie Létoffé, Philippe Delepelaire, Clémence Fournier, Francis Biville, Frédéric Huché, Hélène Cwerman, Najla Benevides Matos)

L’hème, une molécule contenant un atome de fer, est le groupement prosthétique de nombreuses protéines. C’est également une source importante de fer chez les bactéries. Plusieurs espèces bactériennes comme Serratia marcescens, ont des systèmes d’acquisition de l’hème dépendant d’hémophores. Il s’agit de petites protéines extra cellulaires qui, grâce à leur très grande affinité pour l’hème, l’extraient des hémoprotéines et le retournent à des récepteurs spécifiques de la membrane externe (HasR). Les structures 3d de l’apo et de l’holo-hémophore de S. marcescens ont été déterminées, les affinités pour l’hème de l’hémophore et de son récepteur ont été mesurées. Les résidus ligands de l’hème sur les deux protéines ont été identifiés ainsi que la nature des interactions entre l’hémophore et son récepteur. Le transfert de l’hème de l’hémophore qui a une très forte affinité pour l’hème, au récepteur qui a une affinité pour l’hème 1000 fois plus faible que celle de l’hémophore, se produit pourtant sans apport d’énergie. Ce sont les interactions protéine-protéine entre HasA et HasR qui déforment suffisamment la poche de l’hème pour réduire l’affinité de HasA pour l’hème et permettre son captage par HasR (JBC 2006). Le complexe HasA-HasR chargé d’hème a été purifié et cristallisé en collaboration avec le groupe de W. Wellte à Constance. La structure aux rayons X du cristal à une résolution de 2.8 Åest en cours d’analyse. Le transport de l’hème et le relargage des hémophores vides nécessitent de l’énergie. De plus, la liaison de l’holo-hémophore à son récepteur active un facteur sigma spécifique qui induit tout l’opéron has, cette régulation positive permettant une adaptation cellulaire à la source d’hème disponible (J. Bacteriol. 2006).

Par ailleurs, nous étudions un autre récepteur à hème de la membrane externe de S. marcescens, le récepteur HemR que nous avons cloné chez E.coli. Il y est fonctionnel et permet l’acquisition de l’hème. S. marcescens possède aussi deux paralogues de TonB. Nous montrons que l’un d’eux (HasB), dont le gène est localisé dans l’opéron has, est spécifique du récepteur HasR et que l’autre fonctionne avec de nombreux récepteurs de membrane externe (y compris HemR et HasR) comme c’est le cas pour la majorité des orthologues de TonB.

Francis Biville débute un nouveau sujet sur le transport de l’hème chez Bartonella birtlesii et Philippe Delepelaire commence la caractérisation d’un système d’acquisition de l’hème de l’hémopexine constitué par HxuA, (protéine de surface et partiellement sécrétée), HxuC, le récepteur de la membrane externe et HxuB, la protéine de membrane externe permettant la sécrétion de HxuA. Le système entier a été cloné et reconstitué chez E. coli afin de déterminer les mécanismes moléculaires de capture de l’hème de l’hémopexine et de transfert au récepteur HxuC.

Transport de l’hème à travers la membrane interne. (Sylvie Létoffé, Philippe Delepelaire)

Nous venons de montrer par une approche génétique que E. coli avait une perméase à hème constituée de 2 protéines affines périplasmiques DppA et MppA qui toutes les deux fixent l'hème avec une affinité d’environ 10-5M et d’un seul transporteur ABC de la membrane interne DppBCDF. Nos résultats infirment l’hypothèse généralement acceptée d’une diffusion aspécifique de l’hème (molécule hydrophobe) à travers les membranes.

Nous montrons que peptides et hème partagent un même transporteur chez E. coli et nous testons par différentes approches s’il s’agit d’une règle générale (PNAS 2006).

Sécrétion des protéines. (Sandra Cescau, Annick Paquelin, Philippe Delepelaire)

De nombreuses protéines, y compris l’hémophore, sont sécrétées par un transporteur ABC comprenant une ATPase (la protéine ABC) et deux protéines auxilliaires, l’une dans la membrane interne et l’autre de la membane externe appartenant à la famille TolC. Le signal de sécrétion, généralement localisé à l’extrémité C-terminale, interagit avec la protéine ABC, module son activité ATPasique et induit la formation du complexe de sécrétion multiprotéique. Le transporteur ABC multiprotéique des protéases d’Erwinia chrysanthemi a été purifié au laboratoire et sa structure est en cours d’analyse par cryomicroscopie au Biocentrum de Bâle. Un hémophore mutant délété de ses 15 derniers résidus n’est pas sécrété, mais pourtant interagit avec la protéine ABC et induit la formation d’un complexe de sécrétion plus stable que celui induit par la protéine entière in vivo et in vitro. L’apport du signal C-terminal comme molécule indépendante permet la dissociation du complexe (J. Bacteriol. 2007). Nous étudions la dynamique d’association/ dissociation de ce complexe.

ABC protéines sans domaine transmembranaire . (Elie Dassa, Olivier Chesneau)

2 protéines ABC orphelines sont à l’étude au laboratoire.

L’une d’elles, Uup, est impliquée dans l’excision précise des transposons. Uup est une ATPase cytoplasmique qui se lie à l'ADN par un domaine C-terminal présentant de fortes similitudes avec le domaine "Little Finger" (LF) des ADN polymérases translésionnelles. L’hydrolyse de l'ATP est requise pour la fonction d'Uup in vivo (JBC 2006).

L’autre, Vga, est codée par divers plasmides chez les staphylocoques et confère la résistance aux lincosamides et à la streptogramine A, des antibiotiques dont la cible est l’ARN 23S ribosomal. Les deux domaines ABC de la protéine ainsi que leurs motifs d’hydrolyse de l’ATP sont nécessaires à l’expression du phénotype de résistance. Nous tentons de déterminer le mécanisme de la résistance induite par Vga : efflux ou changement de la cible ribosomiale ?

Mots-clés: transport de fer et d’hème, résistance aux antibiotiques par efflux, ABC protéine, sécrétion des protéines, hémoprotéines et hémophores



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