Immunorégulation - CNRS URA 1961  


  RESPONSABLEROGGE Lars / lrogge@pasteur.fr
  MEMBRESDr BIANCHI Elisabetta / Dr FERNANDEZ SANCHEZ Maria Elena / COFFRE Maryaline / SECHET Emmanuel

  Rapport d'activité

Le groupe à 5 ans Immunorégulation poursuit deux projets principaux :

Le rôle du remodelage de la chromatine lors du développement des cellules T auxiliaires

Nous étudions le rôle des signaux transmis à travers le récepteur des cellules T et les récepteurs des cytokines dans l’induction du programme d’expression des gènes spécifiques aux sous populations des cellules T auxiliaires. Nous nous intéressons plus particulièrement aux interactions entre les facteurs de transcriptions et les complexes de remodelage de la chromatine qui interviennent dans les changements épigénétiques et la transcription des gènes pendant le développement des cellules Th1.

Etude d’un nouveau régulateur du processus de l’ubiquitination, le COP9 signalosome

Nous étudions les fonctions biochimiques et moléculaires du COP9 signalosome (CSN) humain, en se focalisant sur le rôle du CSN dans la régulation des processus d’ubiquitination qui contrôlent le cycle cellulaire et l’expression des gènes dans des cellules normales et transformées.

Le rôle du remodelage de la chromatine lors du développement des cellules « T helper » 

La différenciation des cellules naïves T CD4+ en cellules T helper de type 1 (Th1) ou Th2 est un aspect fondamental de la réponse immune aux larges implications dans la défense de l’hôte et la pathogénèse. Les cellules Th1 promeuvent l’immunité médiée par les cellules et sont nécessaires pour débarrasser l’organisme d’agents pathogènes intracellulaires mais peuvent provoquer des maladies inflammatoires chroniques. D’autre part, les cellules Th2 sont essentielles pour combattre les agents pathogènes extracellulaires mais sont associées aux allergies et à l’asthme. Ces résultats montrent que le développement des cellules Th1 et Th2 doit être contrôlé étroitement et que la modulation thérapeutique des réponses immunes peut avoir un impact sur les maladies humaines.

Les lymphocytes T CD4+ naïfs (les précurseurs des cellules Th1 et Th2) sont caractérisés par un petit noyau compact avec une hétérochromatine dense. Cette structure « fermée » de la chromatine constitue une barrière physique à la transcription des gènes et les lymphocytes naïfs ont des taux de transcription très faibles. La stimulation par un antigène initie le processus de différenciation et conduit rapidement à l’apparition d’euchromatine. Les cytokines présentes au moment de la stimulation régulent la différenciation en cellules T effectrices. Les travaux menés ces dernières années ont établi que la différenciation en cellules T effectrices entraîne des changement importants dans la structure de la chromatine des gènes associés à la différenciation terminale (tels que IFN-γ ou les gènes du locus Th2, IL-4, IL-5, and IL-13). Ces modifications « épigénétiques » stables sont transmises aux cellules filles et peuvent expliquer la stabilité des profils de sécrétion de cytokines des cellules Th1 et Th2 différenciées. Nous avons étudié comment les signaux de l’environnement (tels que les cytokines et les ligands du TCR) peuvent induire les modifications de la structure de la chromatine dans les cellules Th1 en développement.

Analyse des mécanismes contrôlant l’expression d’ IL-12Rβ2

L’interleukine-12 (IL-12) est une cytokine clé pour le développement des réponses Th1. IL-12 transmet son signal en se liant à son récepteur constitué de deux sous-unités, IL-12Rβ1 and IL-12Rβ2. Nous avions préalablement démontré que la sous-unité IL-12Rβ2 n’est pas exprimée dans les cellules Th1 mais que son expression est rapidement induite pendant la différenciation Th1. Cependant les mécanismes moléculaires induisant l’expression spécifique de ce récepteur dans les cellules Th1 ne sont pas encore établis.

Afin de déterminer comment l’expression spécifique du récepteur IL-12Rβ2 dans cellules Th1 est contrôlée, nous avons analysé les changements dans la structure de la chromatine au locus IL-12Rβ2 dans les cellules T CD4+ naïves et dans les cellules se différenciant en cellules Th1 et Th2. Nous avons observé deux sites d’hypersensibilité à la DNAse I (HS) dans la région en amont du gène IL-12Rβ2. Ces HS se situent respectivement à 3,2kb (HS1) et immédiatement (HS2) en amont du point d’initiation de la transcription du gène IL-12Rβ2. Le site HS2 est faiblement détecté dans les cellules Th2 et définie le « core promoter » du gène IL-12Rβ2, comme cela a été montré par des essais de gène rapporteur. Le site HS1 apparaît très tôt dans les cellules Th1 mais est absent des cellules Th2. Ces sites HS définissent un élément enhancer qui est reconnu par STAT4 dans des essais de liaison in vitro. De plus, cet élément enhancer peut activer un gène rapporteur en présence d’IL-12 et de STAT4. Par immunoprécipitation de la chromatine (ChIP), nous avons montré, que STAT4 est lié à cet élément enhancer in vivo dans les cellules Th1 en développement mais pas dans les cellules Th2. La réduction de l’expression de STAT4 dans les cellules T CD4+ naïves humaines obtenue par utilisation de l’ARN interférence (siRNA), induit la réduction de l’expression de IL-12Rβ2 et le développement Th1, ce qui confirme l’importance de STAT4 pour l’expression de IL-12Rβ2 au début du développement Th1.

Afin d’identifier les bases moléculaires des changements de structure de la chromatine pendant la différenciation des cellules T effectrices, nous avons analysé le recrutement de complexes de remodelage de la chromatine du type de SWI/SNF au locus IL-12Rβ2. Nous avons montré qe l’activation du TCR est suffisante pour induire un recrutement rapide de BRG1, la sous-unité ATPase du complexe de remodelage BAF, à l’enhancer et au promoteur du gène IL-12Rβ2. Le recrutement de BRG1 est associé à une augmentation rapide de l’acétylation des histones et à un faible niveau de transcription au locus IL-12Rβ2. Les cytokines seules n’induisent pas le remodelage de la chromatine et l’expression du gène IL-12Rβ2, cependant l’activation du TCR en présence de IL-12 ou d’IFN-α induit une augmentation de l’acétylation des régions régulatrices et un fort niveau d’expresssion du gène IL-12Rβ2. D’autre part, la réduction de l’expression de BRG1 ou de STAT4 par l’ARN interférence inhibe l’acétylation des histones aux régions promotrices et enhancer. Ces résultats indiquent un rôle important du remodelage de la chromatine par le complexe BAF induit par le TCR et de l’activation de STAT4 induite par les cytokines pour l’expression de IL-12Rβ2 pendant la développement des cellules Th1 humaines (Letimier et al., EMBO J. sous presse).

Régulation de l’expression du gène T-bet pendant la différenciation des cellules Th1 chez l’homme

Le facteur de transcription T-bet est un des régulateurs clés du développement des cellules Th1. T-bet est exprimé spécifiquement dans les cellules Th1 et induit le remodelage de la chromatine du locus de l’ IFN-γ et l’expression du gène IFN-γ Cependant le mécanisme de contrôle de l’expression spécifique de T-bet dans les cellules Th1 est mal connu. En effet, il n’est pas clairement établi si T-bet induit la différenciation des cellules Th1 en induisant l’expression de IL-12Rβ2 ce qui permet aux cellules de répondre à IL-12, ou si l’expression de T-bet est en aval de la signalisation des cytokines.

Nous avons analysé les mécanismes qui régulent l’expression de T-bet dans les cellules T CD4+ humaines. L’analyse des sites d’hypersensibilité à la DNAse I (HS) et des modifications des histones au cours de la différenciation des cellules Th1, nous a permis d’identifier quatre régions potentielles de régulation du locus T-bet humain. Ces sites HS sont localisés dans les séquences non codantes conservées (CNS) identifiées par alignement des séquences d’ADN génomique de l’Homme et de la souris et présentent une hyperacétylation de l’histone H3 dans les cellules Th1.e

Nous avons montré que la stimulation du TCR des cellules CD4+ naïves est nécessaire et suffisante pour induire l’expression rapide de T-bet. Cette expression est amplifiée par un traitement en présence d’IFN-γ, IFN-α, ou IL-12. L’expression de T-bet induite par le TCR est inhibée par la drogue immunosuppressive Cyclosporine A (CsA) ce qui indique l’implication de NFAT dans la régulation de T-bet. Nous avons aussi montré que, in vivo, NFAT est lié à un site consensus au niveau de HS1 rapidement la stimulation du TCR. Par contre, l’expression de la sous-unité IL-12Rβ2 induite par le TCR, n’est pas inhibée par la CsA. Ces données indiquent que des voies de signalisation sensibles à la CsA ainsi que des voies insensibles à la CsA agissent en parallèle pour contrôler le développement des cellules Th1 humaines.

Nos études des mécanismes régulant l’expression de IL-12Rβ2 et de T-bet pendant la phase précoce de la différenciation des cellules Th1 humaines suggèrent que ce processus est contrôlé par deux voies de signalisation indépendantes qui sont toutes les deux initiées par l’activation du TCR (voir Figure).

Un nouveau régulateur des processus d’ubiquitination : le signalosome COP9

La dégradation contrôlée des protéines par le système « ubiquitine » est importante pour la régulation de nombreux processus cellulaires fondamentaux tels que la prolifération, la différenciation, la modulation des récepteurs des facteurs de croissance et l’expression des gènes. De ce fait, il n’est pas surprenant que des aberrations du système « ubiquitine » soient associées à la pathogenèse de plusieurs maladies, y compris de nombreuses tumeurs. Du fait du rôle essentiel de l’ubiquitination dans la dégradation des protéines qui contrôlent le cycle cellulaire et la transcription des gènes, son activité doit être hautement spécifique et finement régulée. Le complexe signalosome C0P9 (CSN), récemment identifié, pourrait fonctionner comme un régulateur des processus d’ubiquitination chez plusieurs organismes modèles. L’effet pléitotropique du CSN peut être lié à sa capacité à réguler l’activité des ligases de l’ubiquitine «Culline-RING» telles que le complexe SCF. Cependant les mécanismes d’action et les cibles du CSN dans les cellules de mammifères sont mal connues. Le SCF est responsable de la dégradation de nombreux régulateurs intervenant dans le cycle cellulaire et la transcription (comme les inhibiteurs du cycle cellulaire, p27kipl et p21, les cyclines et les éléments de la voie de signalisation de NF-κB ).

Notre projet porte sur l’étude des fonctions biochimiques et moléculaires du CSN humain, en particulier sur le rôle du CSN dans la régulation des processus d’ubiquitination qui contrôlent le cycle cellulaire et l’expression des gènes. Nous avons utilisé la méthode de l’ARN interférence avec l’aide des lentivirus afin de cibler l’expression des sous-unités du CSN. La réduction de l’expression du CSN entraine une augmentation de la dégradation de Skp2 (la sous-unité qui permet à SCFSkp2, une ligase de l’ubiquine, de reconnaître le substrat), la stabilisation d’un substrat de Skp2, l’inhibiteur du cycle cellulaire p27 et une dérégulation de la prolifération cellulaire. La restauration de Skp2 dans les cellules déficientes pour CSN permet de rétablir la progression du cycle cellulaire indiquant que la perte de Skp2 dans ces cellules joue un rôle important dans leur défaut de prolifération. Ces données nous indiquent que le CSN est nécessaire à la stabilisation des composants du SCF et à l’assemblage d’un complexe SCFSkp2 fonctionnel et est donc essentiel pour la progression du cycle cellulaire des cellules humaines.

Mots-clés: différenciation des cellules Th1 et Th2, modifications épigéniques, ubiquitination, transcription, COP9 signalosome

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Deux voies de signalisation indépendantes contrôlent la différenciation des cellules T auxiliaires chez l’homme 1. L’engagement du récepteur des cellules T (TCR) induit le recrutement du complexe BAF au locus d’IL-12Rb2. Ce complexe est impliqué dans le remodelage de la chromatine et l’expression du gène IL-12Rb2. Cette voie de signalisation est insensible à Cyclosporine A (CsA). 2. La signalisation par le TCR induit l’expression T-bet via l’activation de NFAT. Cette voie est inhibée par CsA.

Two independent pathways control human T helper cell differentiation 1) TCR-induced recruitment of the BAF complex initiates IL-12Rb2 locus remodeling and gene expression, which is enhanced by STAT4. This process is CsA-insensitive. 2) TCR signaling induces chromatin remodeling at the T-bet locus and gene expression via activation of NFAT (CsA-sensitive).



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