Génétique Moléculaire - CNRS URA2172  


  RESPONSABLEProf. PUGSLEY Anthony / max@pasteur.fr
  MEMBRESDr FRANCETIC Olivera / Prof. BAYAN Nicolas / Dr BUDDELMEIJER Nienke
Dr KREHENBRINK Martin / Dr RICHET Evelyne / Dr DANOT Olivier / GUILVOUT Ingrid
VIDAL-INGIGLIARDI Dominique / Dr KOLB Annie / Dr NOREL Françoise

  Rapport d'activité

L'unité de Génétique moléculaire étudie des aspects fondamentaux de l'expression génique et du ciblage et d'assemblage de protéines de l'enveloppe chez les bactéries, principalement chez Escherichia coli. Une multitude d'approches de biologie moléculaire, biologie cellulaire, biochimie, biophysique et biologie structurale est employée afin d'obtenir des informations précises sur la structure et la dynamique de composants cellulaires impliqués dans ces processus. Un autre objectif est de caractériser les modifications de l'expression génétique en réponse aux carences et aux stress et plus particulièrement celles qui dépendent du facteur σS de l’ARN polymérase et quijouent un rôle clef dans la survie, la réponse généralisée au stress et la virulence de Salmonella.

Escherichia coli et Salmonella sont des modèles pour l'étude de processus biologiques fondamentaux. Nous continuons à exploiter leurs nombreux avantages pour améliorer nos connaissances du trafic de protéines ainsi que de la perception et de la traduction de signaux dans les circuits de régulation génétique. Les résultats que nous avons obtenus sont d'un intérêt général qui dépasse très largement les frontières de la bactériologie classique.

Une grande partie de nos travaux concerne le système de sécrétion de type II, présent chez la plupart des bactéries à Gram-négatif. La sécrétion par ce système se fait en deux étapes distinctes : la translocation des exoprotéines à travers la membrane interne (généralement par la machinerie Sec) suivie de leur repliement, puis le transport de l'exoprotéine à travers la membrane externe par une machinerie composée de 12 protéines spécifiques. Les éléments clefs de cette machinerie incluent une protéine dodécamérique (la sécrétine) qui forme un canal dans la membrane externe, une chaperone (la pilotine) nécessaire à l'insertion de ce complexe dans la membrane externe, un piston dynamique (le pseudopilus) qui, selon les modèles actuels, pousse les exoprotéines à travers le canal formé par la sécrétine, et un moteur qui fournit de l'énergie au système.

Selon sa structure en microscopie électronique, une grande partie de la sécrétine est exposée sur la face périplasmique de la membrane externe. La protéolyse par la trypsine élimine plus de la moitié de cette partie de la protéine ; la partie qui résiste à la trypsine maintient sa forme dodécamérique et se comporte comme une unité indépendante capable de se multimériser. En association avec la pilotine, ce domaine C-terminal s'associe avec la membrane interne. En l'absence de pilotine, la sécrétine s'insère dans la membrane interne; le rôle de la pilotine, une lipoprotéine) étant d'accompagner la sécrétine à la membrane externe via le système de triage Lol. Nous testons l'hypothèse selon laquelle la sécrétine est capable de s'insérer spontanément. D'autre part, en collaboration avec F. Pecorari, nous avons élaboré des inhibiteurs protéiques spécifiques de l'assemblage et la fonction de la sécrétine. Dans la suite de ce travail, nous souhaitons identifier les épitopes reconnus par ces inhibiteurs et les exploiter pour piéger des intermédiaires dans leur assemblage.

Nous poursuivons également nos études du pseudopilus, et notamment de sa structure et de l'exportation de ses sous unités. Nous venons de montrer que la région N-terminale très hydrophobe des pseudopilines est reconnue par le "signal recognition particle" qui les dirige vers le système Sec dans la membrane interne pour permettre leur translocation vers la face périplasmique de cette membrane.

La modification post traductionnelle des lipoprotéines implique trois enzymes. Toutes les trois sont essentielles à la viabilité bactérienne. Nous étudions plus particulièrement une de ces enzymes, l'apolipoprotéine-N-acyl transférase (Lnt). Après avoir documenté les effets cellulaires qui résultent de son inactivation ou élimination, nous étudions son activité enzymatique avec, comme objectifs, la mise au point d'un système de criblage et l'obtention de données structurales qui doivent nous permettre d'identifier des inhibiteurs capables de tuer les bactéries à Gram-négatif. Nous avons identifié une trentaine d'acides aminés conservés dans toutes les protéines ainsi que dans une famille d'enzymes appelées hydrolases. Plus que la moitié de ces résidus sont essentiels à l'activité de Lnt. L'analyse structurale du domaine catalytique ainsi identifié doit permettre de mieux comprendre son action catalytique et la mise au point d'inhibiteurs spécifiques.

Nos études sur la transduction de signal ont pour origine notre intérêt constant pour le système maltose d'E. coli. Le régulateur central du régulon maltose est la protéine MalT, un activateur transcriptionnel qui se trouve être le prototype d'une nouvelle classe d'ATPases signalisatrices, les protéines STAND (signal transduction ATPases with numerous domains). Ces protéines, ubiquitaires, sont des plates-formes de signalisation qui intègrent des signaux régulateurs et qui, en réponse, renvoient un signal ou exécutent une fonction. A cause de leur complexité structurale, rares sont les protéines STAND qui sont étudiées in vitro, ce qui fait que les mécanismes moléculaires qui gouvernent ces processus de transduction de signal sont mal compris. La protéine MalT est en équilibre entre une forme monomérique, inactive et une forme multimérique, transcriptionnellement active, cet équilibre étant contrôlé par trois effecteurs négatifs (les protéines MalK, MalY et Aes) et par un effecteur positif, le maltotriose. Les trois domaines N-terminaux de MalT : DT1 (domaine ATPase) et DT2 - tous deux caractéristiques des protéines STAND, - et DT3, le domaine senseur, forment un module de transduction de signal qui répond aux signaux régulateurs via un changement de sa structure quaternaire et qui, ce faisant, détermine l'aptitude de DT4, le domaine de fixation à l'ADN, à se fixer sur les promoteurs cibles. Nos objectifs sont de déterminer (a) les mécanismes par lesquels MalT répond à ces signaux positifs et négatifs, ainsi que (b) le rôle de l'activité ATPase de MalT dans le fonctionnement de la protéine.

Nos études portent également sur unrégulon de plus de 300 gènes dont l’expression est coordonnée par le facteur sigma de l’ARN polymérase σS (RpoS). Ce régulon joue un rôle central dans la physiologie des Entérobactéries en phase stationnaire et dans leurs réponses à de multiples stress et il est impliqué dans la formation de biofilm et la virulence de Salmonella. En dépit de nombreuses études, la fonction de près de la moitié des gènes régulés parσS reste inconnue et l’un de nos objectifs consiste à identifier de nouvelles fonctions en caractérisant, par des analyses phénotypiques et protéomiques, des mutants de Salmonella affectés dans des gènes du régulon. Un autre aspect de nos travaux concerne les mécanismes de reconnaissance des promoteurs dépendant de σS et leur réponse différentielle aux stress. Plus récemment, nous avons abordé la caractérisation de facteurs modulant l'expression ou l'activité de σS. Parmi ceux-ci, la protéine Crl apparaît comme un nouveau type de régulateur qui augmente l’activité transcriptionnelle de σS en favorisant sa fixation à l’enzyme cœur de l’ARN polymérase. Les 7 facteurs sigma présents chez les Entérobactéries étant en compétition pour leur fixation à l’enzyme cœur, Crl pourrait favoriser σS au détriment des autres facteurs sigma et en conséquence modifier la répartition des flux de transcription dans la cellule. Nous avons également effectué une caractérisation biochimique du facteur sigma majeur de B. fragilis (σA) qui est phylogénétiquement très proche des facteurs σS et qui apparaît comme le prototype d’une nouvelle classe de facteurs sigma principaux, restreints à une seule branche de l’évolution bactérienne, les bacteroidetes et les chlorobi.

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