Développement des Lymphocytes - INSERM U668  


  RESPONSABLEDr SIMOES DE BIVAR CUMANO Ana / cumano@pasteur.fr
  MEMBRESDr BANDEIRA Antonio / BURLEN-DEFRANOUX Odile / DESANTI Guillaume
Dr GODIN Isabelle / Dr GOLUB Rachel / Dr KIEUSSEIAN Aurélie / LALANNE Ana Ines
Dr MORDELET Elodie / Dr PEFFAULT DE LA TOUR Régis / PEREIRA DE SOUSA Ana Patricia
Dr PEREIRA Pablo / POSSOT Cécilie / Dr VIEIRA Paulo / Dr ZUBER Julien

  Rapport d'activité

L'unité du Développement des Lymphocytes a recherché la compréhension des événements importants dans l'établissement du système immunitaire: 1. L'établissement du système hématopoïétique au cours de l'embryogenèse; 2. Le développement et la physiologie des lymphocytes T γδ; 3. L'ontogenèse, les répertoires et la physiologie des cellules T régulatrices, importantes dans l'homéostasie du système immunitaire.

Établissement du système hématopoïétique, chez l'embryon de souris. (A. Cumano).

Les cellules hématopoïétiques souches (CHS) sont fondamentales pour le maintien de la production de cellules sanguines. Les CHS ou leurs précurseurs directs ne sont pas générés dans les organes hématopoïétiques, mais elles ont une origine exogène.

Nous avons établi que les CHS sont générées, entre le 9ème et le 12ème jour de la gestation, chez la souris, à partir de précurseurs du mésoderme intra-embryonnaire, dans une région dénommée splanchnopleure (Sp), et plus tard AGM (Aorte, Gonades, Mésonéphros) dans l'aorte dorsale. Nous avons réussi à identifier des marqueurs de surface et isoler les CSH par cytométrie de flux et nous avons analysé le profil d'expression de différents gènes impliqués dans le développement hématopoïétique. Des marquages en immunocytochimie ont permis de postuler que les CHSs sont générées dans le mésenchyme sous-aortique dans des plages cellulaires.

Dans cette région du mésoderme intra-embryonnaire, se trouvent d'autres progéniteurs mésodermiques qui peuvent avoir un rôle dans la génération et/ou la survie des CSH. Nous identifions en ce moment les différents types cellulaires qui co-existent dans cette région et leur relation avec les CHS.

Développement de lymphocytes B chez des souris IL-7-/-. (P. Vieira et A. Cumano).

En l'absence d'Interleukine 7 (IL-7), le nombre des lymphocytes T et B dans les organes lymphoïdes périphériques est réduit d'environ dix fois. Nos études ont démontré que la lymphopoïèse B est complètement interrompue dans la moelle osseuse d'animaux IL-7-/- à partir de l'âge de sept semaines, en illustrant ainsi le rôle essentiel de cette interleukine dans la production de lymphocytes B dans la moelle osseuse. Le rôle de l’IL-7 est apparent au niveau des précurseurs lymphoïdes communs (CLP) où elle est fondamentale pour maintenir leur capacité à générer des lymphocytes B par modulation de l’expression de EBF, un facteur de transcription important dans la détermination du lignage B.

Nous avons identifié la " Thymic stromal lymphopoietin " (TSLP) comme le facteur responsable de la lymphopoïèse B fœtale, chez les souris IL-7-/-. Les souris inactivées pour le Flk2/Flt3 et pour le récepteur à l’IL-7 n’ont pas de cellules B ce qui implique le Flt3 dans la formation de 1% des cellules B de la souris. Nous avons par la suite montré que la TSLP a aussi un rôle dans l'expansion de lymphocytes B après l'expression du pré-BCR, dans la moelle osseuse.

Nous avons croisé les souris IL-7-/- avec les souris Flt3 ligand-/- et ainsi obtenu des souris qui expriment le TSLP en absence de ces deux cytokines. Nous analysons à présent les sous-populations de progéniteurs B dans cette double mutante par cytométrie de flux et par des tests de différenciation in vitro et in vivo.

En collaboration avec le groupe de transplantation de moelle osseuse de l’Hôpital St. Louis, nous étudions l’effet de ces cytokines dans le développement de cellules B chez l’humain.

Expression des gènes TLR4 au cours de l'ontogenèse B. (P. Vieira).

Nous avons montré que le gène codant pour le TLR4, impliqué dans la réponse à des produits bactériens dont le LPS, est exprimé de façon monoallélique chez les lymphocytes B à partir du stade de cellule pré-B, et dans les granulocytes de la moelle osseuse. Ce pattern d'expression ressemble à l'inactivation du chromosome X. L'étude du rôle de la présence de récepteurs TLR dans les lymphocytes B est activement poursuivie.

Exclusion allélique et isotypique des gènes du TCRγδ . (Laurent Boucontet, Pablo Pereira)

La majorité des lymphocytes exprime un seul récepteur à l'antigène à la surface cellulaire. Ce phénomène, connu sous le nom d'exclusion allélique, résulte de différents mécanismes selon le locus impliqué. Nous avons développé un système expérimental permettant l'analyse des réarrangements TCRγet TCRδ dans la progéniture d'une cellule Tg avec une efficacité proche de 100%. Nous avons analysé près de 250 clones T γ sélectionnés à la base par l'expression de différentes chaînes γ à la surface par l'utilisation, au moment du tri, des Abs monoclonaux spécifiques des différentes chaînes γ que nous avions produites auparavant. Plusieurs informations importantes et plusieurs conclusions se dégagent de ces analyses. Premièrement, les résultats suggèrent une hiérarchie dans les probabilités auxquelles les différents segments Jγ et Vγ s'engagent dans le processus de recombinaison. Deuxièmement, même si la fréquence de cellules T γcontenant deux chaînes γ(ou plus) réarrangées fonctionnellement est importante, il semblerait que seule une chaîne γest exprimée à des niveaux détectables à la surface cellulaire. Ceci est le résultat du fait que plusieurs chaînes γne peuvent former des hétérodimères qu'avec un nombre restreint de chaînes δ. Troisièmement, moins de 1% des cellules T γ matures contiennent les deux allèles de la même chaîne γréarrangés fonctionnellement, ce qui suggère que les deux allèles ne sont pas accessibles à l'action de la recombinase au même moment. Quatrièmement, les précurseurs des cellules T γn'essayent pas de réarranger tous les segments Jγ.

Ontogenèse et répertoire des lymphocytes T CD4+ régulateurs FOXP3+. (A. Bandeira).

Les cellules T régulatrices CD4+ CD25+jouent un rôle primordial dans le maintien de la tolérance périphérique aux antigènes du soi, dans la régulation des réponses immunitaires innées et adaptatives aux pathogènes. Nous avons montré que cette population est un élément clé des mécanismes homéostatiques systémiques qui contrôlent le nombre total de lymphocytes périphériques.

L'idée dominante sur l'origine de ces cellules est qu'elles ne sont exportées du thymus qu'après le 4ème jour de la naissance. Nos études montrent que ceci n'est pas le cas car les nouveaux-nés de 3 jours ont déjà une population T CD4+CD25high, exprimant des taux élevés de Foxp3, bien représentée en périphérie. Ce potentiel de régulation se développe considérablement en l'absence d'apport thymique ultérieur. Ainsi à l'age adulte, ces souris ont un nombre très élevé de cellules T CD4+CD25high exprimant Foxp3, et ceci indépendamment du développement de gastrite autoimmune. Ces cellules sont capables de contrôler le déclenchement de la maladie inflammatoire de l'intestin et l'expansion T CD4+ in vivo. Nous venons de confirmer ces résultats en identifiant directement le nombre de cellules FOXP3+ par cytométrie de flux. La genèse du compartiment des cellules T CD4+ régulatrices et naïves périphériques n'est donc pas contrôlée de manière différentielle. Ceci explique pourquoi l'incidence/sévérité des maladies autoimmunes survenant après thymectomie est très variable et compatible avec la survie des animaux, un phénotype complètement différent de celui des souris Foxp3 ko.

Nous montrons aussi que la diversité structurelle du répertoire des TcRs des cellules T régulatrices CD4+ CD25high est proportionnellement similaire à celle des lymphocytes T CD4+ naïfs, mais 10 fois plus petite étant donné la différence de taille entre les deux populations. Par ailleurs, les deux répertoires ne partagent pas de TcRs identiques suggérant très fortement que les deux populations reconnaissent des ligands différents.

Ces études démontrent l’énorme potentiel de reconnaissance des cellules régulatrices et établissent d’importantes différences qualitatives et quantitatives entre les répertoires régulateur et naïf qui ont un impact majeur dans la compréhension du développement des deux types de cellules et la régulation des réponses immunitaires

Mots-clés: Hématopoïèse, développement lymphocytaire, cellules T gd, cellules T régulatrices, greffes

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Figure. Newly generated hematopoietic stem cells emerging from the ventral aspect of the aorta.



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