Biophysique des macromolécules et de leurs interactions (Plate-forme)


  RESPONSABLEDr ENGLAND Patrick / england@pasteur.fr
  MEMBRESHOOS Sylviane

  Rapport d'activité

Les approches biophysiques à l'échelle moléculaire sont un lien privilégié entre les descriptions structurales à l'échelle atomique et les études spatio-temporelles in situ, fournissant des informations indispensables sur l'énergétique et la dynamique des macromolécules biologiques et de leurs assemblages.

La Plate-forme de Biophysique des Macromolécules et de leurs Interactions (PFBMI) fédère un ensemble de 13 équipements de pointe, unique en France, associé à un véritable savoir-faire technique et méthodologique, créant ainsi un environnement scientifique propice à une recherche de haut niveau.

Les appareils gérés par la plate-forme sont accessibles à tous les chercheurs de l'Institut Pasteur et de son Réseau International, ainsi qu’à la communauté scientifique en général.

L'adresse biophysique@pasteur.frest à la disposition de toute personne souhaitant des conseils ou désirant soumettre un projet à la PFBMI. Des instructions et formulaires téléchargeables sont disponibles sur notre site Web comme support pour ces demandes. Trois modalités d'étude sont envisageables selon les cas:

  1. mise à disposition des appareils, pour des utilisateurs ayant suivi avec succès une formation leur permettant d’acquérir une autonomie opérationnelle.

  2. prestation de service: réalisation d'expériences de routine dans des conditions standardisées.

  3. collaboration scientifique, avec nomination d’un “responsable de projet” au sein du Comité Scientifique de la PFBMI (voir site Web).

Technologies disponibles:

* Résonance plasmonique de surface (responsable scientifique : Patrick ENGLAND ; responsable technique : Sylviane HOOS).

L’appareil Biacore 2000 (http://www.biacore.com) permet l’analyse des interactions moléculaires en temps réel. Dans ce but, un des partenaires de l’interaction est immobilisé, de manière covalente ou non covalente, et l’autre partenaire passe au contact de cette surface grâce à un flux continu de tampon. Cette technique est particulièrement adaptée à la détermination des vitesses d’association (kon) et de dissociation (koff) entre macromolécules biologiques. L'appareil est entièrement automatisable, ce qui facilite la réalisation de séries d'expériences hautement reproductibles.

* Microcalorimétrie (responsable scientifique : Francis SCHAEFFER ; responsable technique : Sylviane HOOS).

La microcalorimétrie permet la caractérisation thermodynamique des interactions entre molécules en solution, et des réactions biochimiques en général. La PFBMI dispose de deux types de calorimètres (fabricant : Microcal ; http://www.microcalorimetry.com/), selon les grandeurs que l’on veut mesurer.

  • Le calorimètre de titration isotherme (modèles MCS-ITC et VP-ITC) : celui-ci est principalement dédié à l’étude des interactions moléculaires. En mesurant la chaleur de réaction à température constante, l’ITC permet la détermination directe de la stœchiométrie (n), de la constante d’équilibre (Ka), et des variations d’enthalpie (H) et d’entropie (S) de la réaction d’association. L’analyse à plusieurs températures donne la variation de la capacité calorifique (Cp) associée à la formation du complexe moléculaire.

  • Le calorimètre à balayage de température (modèle VP-DSC) : celui-ci est principalement dédié à l’étude de la stabilité thermique des macromolécules et de leurs complexes. En mesurant la variation de la capacité calorifique (∆Cp) en fonction de la température, le DSC permet de déterminer directement les variations d’enthalpie (H) et d’entropie (S), et la température de demi-transition (Tm), associées à chaque transition structurale. L’accessoire de Calorimétrie à Perturbation de Pression (PPC), le premier de son genre en France, permet la caractérisation des propriétés volumétriques des macromolécules, et notamment de leur coefficient d’expansion thermique.

* Dichroïsme circulaire (responsable scientifique : Alain CHAFFOTTE ; responsable technique: Bruno BARON). 

La PFBMI dispose d’un appareil de dichroïsme circulaire récent (modèle Aviv 215 ; http://www.avivbiomedical.com), incluant des accessoires de fluorescence totale et de titration, et d’un appareil plus ancien (modèle Jobin-Yvon CD6) muni d’un accessoire “stopped-flow” (Bio-Logic ; http://www.bio-logic.info/rapid-kinetics/index.html)

L’étude des macromolécules (et notamment des protéines) par dichroïsme circulaire permet l’analyse de leur repliement secondaire et tertiaire. Pour les protéines, la mesure du dichroïsme circulaire dans l’UV lointain (180-260 nm) permet de déterminer leur contenu en structure secondaire, alors que les signaux dans l’UV proche (250-330 nm) fournissent des informations sur leur repliement tertiaire.

La stabilité thermique du repliement peut être déterminée en appliquant un gradient de température à l’échantillon (figure 1). De façon similaire, il est possible de quantifier la stabilité conformationnelle d’une molécule à température constante et les changements structuraux induits par la formation de complexes en effectuant un titrage, respectivement par un agent dénaturant ou un ligand. Finalement, des études cinétiques peuvent être effectuées grâce à un accessoire de mélange rapide (“stopped-flow").

* Spectroscopie infrarouge (responsable scientifique : Alain CHAFFOTTE; responsable technique: Bruno BARON).

La spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) permet d’étudier la structure secondaire de macromolécules, en analysant les fréquences d’absorption de certains groupements chimiques caractéristiques (notamment la liaison peptidique en ce qui concerne les protéines). Cette technique apporte des informations complémentaires de celles qui sont fournies par dichroïsme circulaire, et est particulièrement adaptée à l’étude de la structure secondaire des protéines comportant une forte proportion de structures en feuillet ß. L’appareil dont dispose la PFBMI (FTLA2000-104 ; fabricant : ABB ; http://www.abb.com/analytical) a été équipé récemment d’un accessoire de réflectance totale atténuée (ATR) DuraSamplIR (SensIR; http://www.sensir.com/newsensir/in_lab/DuraSamplIRII.html).

* Spectroscopie de fluorescence (responsable scientifique : Fabrice AGOU; responsable technique: Bruno BARON).

La spectroscopie de fluorescence est une technique versatile qui permet d’analyser, à l’équilibre ou en temps réel, les variations de l’environnement de sondes fluorescentes intrinsèques (notamment tryptophanes pour les protéines) ou extrinsèques (fluorophores synthétiques). Elle peut s’appliquer à la fois à l’étude de la stabilité conformationnelle des macromolécules, à la caractérisation des interactions moléculaires et à la quantification d’activités enzymatiques. Deux types de grandeurs peuvent être quantifiés avec les appareils présents à l’Institut Pasteur: l’intensité et la polarisation (ou anisotropie) de la fluorescence.

La PFBMI dispose à la fois d’un fluorimètre standard à forte sensibilité (Quantamaster C60 ; fabricant : Photon Technology International ; http://www.pti-nj.com/quantamaster.html), et d’un appareil “stopped-flow” (KinetAsyst SF61-DX2 ; fabricant : Hi-Tech ; http://www.hi-techsci.com/) permettant de déterminer les propriétés de réactions rapides avec une résolution de quelques milli-secondes.

* Ultracentrifugation analytique (responsable scientifique : Thierry ROSE). 

Le comportement hydrodynamique d’une macromolécule et son coefficient de sédimentation sont liés au volume, à la forme, à la densité et à la masse de la molécule. L’ultracentrifugation analytique permet de mesurer directement la masse d’une macromolécule en solution : s’il s’agit d’un oligomère ou d’un complexe non covalent, le nombre de chaînes associées au sein de la molécule native ou la stœchiométrie du complexe peuvent ainsi être déterminés. Des informations peuvent également être obtenues sur la conformation des macromolécules et la constante d’équilibre des assemblages, ainsi que sur l’homogénéité des échantillons. La PFBMI a acquis récemment une ultracentrifugeuse ProteomeLab XL-I dotée d’un double système de détection UV/visible et interférentiel, et dispose en outre d’une ultracentrifugeuse Optima XL-A (fabricant : Beckman-Coulter ; http://www.beckman.com/products/splashpage/xla/default.asp).

* Diffusion statique de la lumière et viscosimétrie (responsable scientifique : Alexandre CHENAL)

L'intensité de diffusion de la lumière d'une solution est directement proportionnelle à la masse moléculaire moyenne et à la concentration de l'ensemble de ses composants. La PFBMI dispose d'un détecteur multiple (TDA 302; fabricant: Viscotek ; http://www.viscotek.com/triple_detector_array_with_LALS_and_UV.php4), couplé à un système chromatographique d'exclusion stérique GPCmax (figure 2). Celui-ci comporte, outre des détecteurs de diffusion de la lumière à plusieurs angles, un réfractomètre/spectrophotomètre UV-visible et un viscosimètre.

Ce dispositif en ligne permet la détermination simultanée de la masse moléculaire, la viscosité intrinsèque et le rayon hydrodynamique de chacun des constituants de la solution, ce qui s'avère particulièrement utile pour caractériser leur taille et la stoechiométrie de leurs assemblages dans différentes conditions expérimentales.

* Diffusion dynamique de la lumière(responsable scientifique : Patrick ENGLAND).

L’étude du mouvement de particules en solution par diffusion dynamique (ou quasi-élastique) de la lumière permet de quantifier leur vitesse de diffusion, et d’en déduire leur rayon hydrodynamique (grandeur qui dépend notamment de leur masse et de leur forme). L’appareil dont dispose l’Institut Pasteur (DynaPro MS800 ; http://www.wyatt.com/solutions/hardware/DynaProTitan.cfm) est particulièrement adapté à l’étude de l’homogénéité de préparations macromoléculaires, et permet de détecter la présence d’agrégats de haut poids moléculaire avec une très forte sensibilité.

Résultats :

Depuis sa création en 2002, la PFBMI s’est investie dans plus de 110 projets, impliquant 29 entités de l’Institut Pasteur (de 9 départements scientifiques sur 10), ainsi que 27 laboratoires extérieurs, aboutissant notamment à 28 publications dans des revues internationales à comité de lecture. De nombreux projets ont été de nature transversale, faisant appel à deux méthodologies ou plus de la PFBMI.

Quelques-uns des projets ayant abouti à des publications au cours des deux dernières années sont les suivants:

* Etude du rôle des modifications post-traductionnelles dans le mécanisme de relargage de la protéine HP1 associée aux queues d’histone

* Etude du couplage entre trimérisation de la glycoprotéine du virus de la rage et interaction avec le récepteur du facteur de croissance nerveux p75NTR

* Caractérisation calorimétrique de la structure oligomérique de la GMP kinase de E. coli

* Optimisation méthodologique de la détermination de structures secondaires de protéines par spectroscopie infra-rouge ATR

* Etude des changements conformationnels induits par le calcium dans le domaine RTX de la toxine adénylcyclase de Bordetella pertussis

* Détermination de l’effet de mutations naturelles pathogènes de la protéine modulatrice NF-κB de NEMO sur sa stabilité et son oligomérisation

* Etude structure-fonction de différentes cibles potentielles de nouveaux traitements antituberculeux (Grand Programme Horizontal sur la Tuberculose)

Situation géographique :

La PFBMI est localisée sur 3 sites : Metchnikoff (bureau de la Plate-forme, résonance plasmonique de surface, microcalorimétrie, dichroïsme circulaire, diffusion dynamique et statique de la lumière, ultracentrifugation analytique), Monod (fluorimétrie) et Lwoff (spectroscopie infrarouge, dichroïsme circulaire).

Mots-clés: physico-chimie, spectroscopie, thermodynamique, cinétique, protéines, sucres, acides nucléiques

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figure 1: Etude de la dénaturation thermique d'une protéine suivie par dichroïsme circulaire dans l'UV lointain.
figure 2: Détecteur multiple Viscotek TDA302 couplé à un système de chromatographie d'exclusion stérique GPCmax (installé en novembre 2006)



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