Biochimie des Interactions macromoléculaires - CNRS URA2185  


  RESPONSABLEDr LADANT Daniel / ladant@pasteur.fr
  MEMBRESDr CHENAL Alexandre / Dr KARIMOVA Gouzel / Dr WOZNIAK Anna

  Rapport d'activité

Les recherches dans l’unité BIM sont focalisées sur l’étude des mécanismes moléculaires qui gouvernent les interactions protéine-protéine et les interactions protéine-membrane. Ces questions sont abordées, pour l’essentiel, en utilisant comme système modèle une toxine bactérienne, l’adénylcyclase (CyaA) produite par Bordetella pertussis, l’agent de la coqueluche. Les connaissances fondamentales concernant les mécanismes d’entrée de la toxine AC dans les cellules cibles et son interaction avec divers effecteurs cellulaires sont exploitées pour différentes applications en vaccinologie et biotechnologie. Nous poursuivons actuellement deux thèmes principaux de recherche :

I - Mécanismes moléculaires d'action de la toxine CyaA

La toxine adénylcyclase (CyaA) est l'un des facteurs de virulence essentiels de B. pertussis. CyaA est capable d'envahir des cellules eucaryotes où elle est activée par la calmoduline pour générer une surproduction d’AMPcyclique, toxique pour les cellules cibles. CyaA est une protéine monomérique de 1706 acides aminés qui présente un mécanisme original de pénétration dans les cellules eucaryotes, schématiquement illustré dans la Figure 1. Dans une première étape, la toxine se lie, via son domaine C-terminal (appelé RTX, en rouge dans la Figure 1) à un récepteur, l’intégrine αMβ2,θ sur le schéma) présent à la surface de certains leucocytes. Dans un deuxième temps, la région centrale constituée de segments hydrophobes (bleue) s’insère dans la membrane plasmique des cellules cibles, puis dans une troisième étape, le domaine catalytique N-terminal (vert) est transloqué à travers la membrane vers le cytoplasme des cellules.

En 2006, nos études ont porté principalement sur la caractérisation du domaine C-terminal de CyaA, qui est impliqué dans l'interaction avec le récepteur αMβ2, ainsi que dans la liaison du calcium, un co-facteur essentiel pour l'entrée de la toxine dans les cellules cibles. Ce domaine est constitué d’une quarantaine de répétitions d’un motif de 9 acides aminés, appelé RTX (pour Repeat in ToXin) : chacun de ces motifs RTX est capable de fixer un ion calcium. Nous avons montré, par une combinaison d'approches spectroscopiques et biochimiques, que lors de la liaison des ions calciums, le domaine RTX subit un changement conformationnel de grande ampleur. Par ailleurs, la caractérisation des propriétés hydrodynamiques du domaine RTX a révélé que la liaison du calcium contrôle la transition entre une conformation étendue, hautement hydratée et une conformation compacte très stable. Ces résultats ont des implications directes pour ce qui concerne la sécrétion de ce polypeptide par les bactéries - qui est effectuée par une machinerie de sécrétion de type I - ainsi que pour la liaison avec le récepteur αMβ2.

D’autre part, nos travaux antérieurs réalisés en collaboration avec l’équipe de C. Leclerc (Régulation Immunitaire et Vaccinologie, Institut Pasteur) ont établi que la protéine CyaA constitue un système vecteur non-réplicatif très efficace pour délivrer des antigènes d’intérêt dans les cellules présentatrices d’antigènes, et induire des réponses immunitaires à médiation cellulaire. Les travaux plus récents ont montré que CyaA peut également stimuler des réponses immunitaires humorales contre l'antigène(s) greffé. En l’occurrence, une protéine CyaA recombinante portant la protéine TAT du virus de l’immunodéficience humaine (VIH) est capable d’induire, chez le singe vert, des titres très élevés d’anticorps neutralisants ( i.e. capables de neutraliser l’activité transactivatrice de la protéine Tat dans un test cellulaire in vitro).

II - Analyse in vivo d'interactions protéine-protéine

Notre deuxième thème de recherche est l'étude des interactions protéine-protéine in vivo notamment grâce à une technologie « double-hybride » (BACTH) développée antérieurement dans l’équipe. Ce test génétique est fondé sur la complémentation fonctionnelle entre deux fragments du domaine catalytique de CyaA, pour reconstituer une cascade de signalisation AMPc dans une bactérie Escherichia coli cya (c’est-à-dire délétée de son adénylcyclase endogène). Actuellement, nous exploitons ce crible génétique pour étudier plus particulièrement l'assemblage des différents composants de la machinerie de division cellulaire d'E. coli. Pour cela, l’analyse d'interaction in vivo entre ces composants à l’aide du système BACTH est combinée avec des approches génétiques et des techniques de localisation de protéine in situ en utilisant des fusions avec la « green fluorescent protein » (GFP). En 2006, nous avons caractérisé un composant putatif de l'appareil de division cellulaire, YmgF, un petit polypeptide de 72 résidus possédant 2 segments trans-membranaires. YmgF a été isolé par criblage « double-hybride » et s’avère interagir avec plusieurs autres protéines de la division cellulaire. Il pourrait servir de protéine adaptatrice pour moduler l'assemblage du septum.

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