Unité: Pathogénie Bactérienne des Muqueuses

Responsable: LABIGNE Agnès

Les travaux de l'Unité portent sur l'étude du pouvoir pathogène de bactéries colonisant les muqueuses : Helicobacter pylori qui est une bactérie impliquée dans la genèse des pathologies gastro-duodénales inflammatoires (gastrites chroniques, ulcères peptiques, et néoplasies gastriques) et les Escherichia coli pathogènes qui sont associés à des diarrhées et des infections extra-intestinales (infections urinaires, méningites, septicémies). Génomique fonctionnelle et comparative, études des interactions des bactéries avec les cellules épithéliales et voies de signalisation qu'elles induisent in vitro et dans des modèles d'infection expérimentale, caractérisation des lésions génotoxiques associées au processus inflammatoire, identification de nouvelles cibles thérapeutiques, études épidémiologiques figurent parmi les approches mises en œuvres pour l'étude de ces pathogènes des muqueuses.

Bactéries du genre Helicobacter

La prévalence des infections à H. pylori est extrêmement importante puisqu'elle atteint 30 % de la population dans les pays industrialisés et 80 à 95 % dans les pays en voie de développement. C'est très probablement l'infection bactérienne la plus répandue à la surface du globe et les pathologies sévères qu'elle induit constituent un enjeu économique de première importance : rappelons que 10 % de la population dans nos pays souffrent d'ulcères peptiques, et 1 % des personnes infectées par H. pylori développeront une néoplasie gastrique (adénocarcinome ou lymphome). Différents projets sont à l'heure actuelle développés qui ont pour but de mieux comprendre l'adaptation de cette bactérie à la muqueuse gastrique, sa biodiversité, et les mécanismes mis en jeu pour générer les lésions épithéliales.

La réponse adaptative de H. pylori à l'environnement gastrique (Hilde De Reuse avec Kerstin Stingl, Marie Thibonnier, Kristine Schauer et Chantal Ecobichon).

Des approches de génétique et de génomique fonctionnelle (transcriptomique et protéomique) ainsi que des modèles animaux sont utilisés pour explorer la réponse de H. pylori à l'environnement gastrique. Nous avons observé que l'acidité est un signal modulant l'expression de différents facteurs de virulence comme l'uréase ou la cytotoxine vacuolisante VacA. Les réseaux de régulation impliqués dans cette réponse mettent en jeu des régulateurs dépendants des métaux (NikR et Fur) et un régulateur essentiel d'un système à deux composants (OmpR-like). La structure tridimensionnelle du régulateur à nickel, NikR de H. pylori, et ses spécificités (ou particularités ou caractéristiques) ont été élucidées après cristallogenèse (collaboration avec L. Terradot, ESRF Grenoble) et mutagenèse dirigée. Le rôle de deux anhydrases carboniques de H. pylori (CA-HP) dans cette réponse adaptative a également été analysé. Ces enzymes catalysent l'interconversion du dioxyde de carbone et du bicarbonate et, chez certains organismes, sont impliquées dans l'homéostasie de pH. Les simples et doubles mutants construits sont affectés dans leur réponse à l'acidité dépendante de l'uréase, dans leur production d'ammoniac et dans leur capacité à coloniser la muqueuse gastrique dans le modèle murin et à y induire une réponse inflammatoire. Les anhydrases carboniques constituent donc de nouveaux acteurs impliqués dans la réponse adaptative de H. pylori à l'environnement gastrique.

Métabolisme et role du peptidoglycane (PG) (Ivo G. Boneca avec Catherine Chaput, Chantal Ecobichon)

L'analyse génétique et biochimique des hydrolases Slt, MltD et AmiA impliquées dans l'assemblage périplasmique du PG chez H. pylori révèle leur rôle dans la croissance, la morphologie et la modulation de la réponse immunitaire innée. AmiA est impliquée dans la division cellulaire de H. pylori et dans la transformation morphologique de sa forme spiralée en forme coccoide. Cette transformation, qui s'accompagne de changements de la structure du PG, est bloquée dans le mutant amiA et s'accompagne d'un échappement au système Nod1/Nod2. Slt est une transglycosylase lytique nécessaire au relargage des fragments du PG. Un mutant slt est affecté dans sa capacité à induire une réponse inflammatoire sur les cellules épithéliales gastriques. MltD, elle aussi caractérisée comme transglycosylase lytique, joue un rôle dans le remodelage du PG et dans la transition de la forme cultivable vers celle d'une forme non-cultivable de H. pylori qui précède la transition morphologique spiralée/coccoide. Enfin, des mutants défectifs en Slt, MltD ou AmiA sont affectés dans leur capacité à coloniser la muqueuse gastrique de la souris. Ainsi, les hydrolases constituent des nouvelles cibles thérapeutiques contre H. pylori.

Le rôle du peptidoglycane (PG) dans la réponse immune innée aux infections bactériennes chez la drosophile (collaboration avec J. Royet CNRS, Strasbourg pour la caractérisation des " peptidoglycan recognition proteins ", PGRPs) et les mammifères fait également l'objet d'études. Chez les mammifères, la reconnaissance du PG passe par les voies Nod1 et Nod2. Nous avons montré que la reconnaissance du PG par la voie Nod1 est nécessaire à une bonne réponse aux infections par Pseudomonas aeroginosa. Ces travaux sont poursuivis dans le cadre d'un projet transversal de recherche sur le métabolisme du PG et le lien avec la réponse immunitaire innée lors de l'infection par différents pathogènes comme Helicobacter pylori, Neisseria meningitidis, Yersinia ou Listeria.

Etude de la réponse de l'hôte et de la génotoxicité associées à l'infection par H. pylori (Eliette Touati avec Jose Ramos Vivas et Valérie Michel)

En collaboration avec Béatrice Régnault (Plate-Forme puces à ADN, Institut Pasteur), la réponse de l'hôte à H. pylori a été analysée chez la souris après 6 et 12 mois d'infection (puces Affymetrix). Environ 200 gènes montrent une expression modulée par l'infection, dont 25 % sont retrouvés communément après 6 et 12 mois. Ils sont majoritairement impliqués dans la réponse immunitaire, la cascade de signalisation, le réarrangement du cytosquelette ou la régulation de la transcription. Les expériences sont en cours pour valider ces résultats d'une part et identifier parmi ces gènes des candidats potentiels impliqués dans la génotoxicité associée à l'infection. En effet, lors d'une étude précédente chez les souris " Big Blue " permettant de mesurer et de quantifier l'effet mutagène induit au niveau des organes, nous avons montré qu'une infection chronique par la souche SS1 de H. pylori entraîne au bout de 6 mois un effet mutagène au niveau des cellules épithéliales gastriques résultant en partie de l'induction de dommages oxydatifs, en particulier des lésions 8 oxo guanines. Ces lésions sont spécifiquement réparées par l'ADN glycosylase OGG1. L'influence de cette enzyme sur les réponse inflammatoire et mutagène à l'infection a été analysée chez les souris big blue OGGI-/-. De façon surprenante, en absence d'OGG1 l'inflammation induite par l'infection est moins sévère que celle observée dans le contexte sauvage et aucune activité mutagène au niveau gastrique n'est détectée, soulignant l'influence de l'inflammation dans l'activité mutagène liée à l'infection et suggérant pour OGG1 un rôle modulateur dans la réponse inflammatoire en plus de son activité de réparation des lésions à l'ADN.

Analyse génétique, biochimique et structurale des fonctions associées à la réparation des lésions à l'ADN, aux mécanismes de recombinaison, et au contrôle de l'initiation de la réplication chez H. pylori (Eliette Touati, Agnès Labigne avec Aurélie Mathieu, Chantal Ecobichon, et Anna Pawlik, en collaboration avec Pablo Radicella, CEA Fontenay-aux-roses et J. Zakrzewska-Czerwinska, Pologne).

L'objectif de ces études est de caractériser chez H. pylori les systèmes biologiques qui apparaissent distincts de ceux communément trouvés chez les autres bactéries et d'en étudier leur spécificité et leur impact. Ainsi, la protéine MutS de la famille MutS2 n'est pas impliquée dans le système de correction des mésappariements de bases qui est absent chez H. pylori, mais a une action anti-recombinogène. Le rôle de MutS dans la capacité des bactéries à acquérir de nouveaux caractères et leur adaptation à l'hôte est analysé dans le modèle murin. De même, les protéines impliquées dans le contrôle de l'initiation de la réplication chez E. coli sont absentes du génome de H. pylori. L'approche du double-hybride a permis d'identifier un certain nombre de protéines candidates qui font l'objet d'études biochimiques et structurales.

Génomique comparative des isolats cliniques de H. pylori (Agnès Labigne avec Jean-Michel Thiberge en collaboration avec les Plates-Formes PT2 et 3 de la Génopole)

La génétique comparative menées sur 120 souches de H. pylori (Hp) recueillies en France a permis d'analyser la distribution de 213 gènes non ubiquistes en fonction des pathologies auxquelles ces souches étaient associées (gastrites, ulcères, métaplasie gastrique, lymphome du MALT). Les profils de distribution cumulée des gènes par pathologie diffèrent significativement. Une classification hiérarchique utilisant l'ensemble des résultats d'hybridation permet d'identifier des sous-classes, l'une de ces sous-classes ne comporte que des souches dépourvues d'îlot de pathogénicité et exclusivement isolées de patients présentant un lymphome de MALT. La souche B38 représentative des souches de ce sous-groupe a été choisie pour ses propriétés génétiques (transformabilité), son aptitude à coloniser la muqueuse gastrique de la souris pour en déterminer la séquence génomique et identifier les propriétés intrinsèques de cette souche.

ESCHERICHIA COLI PATHOGÈNES

Escherichia coli, l'objet de nombreuses études biochimiques et génétiques, est l'un des microorganismes les plus étudiés. Bien que la plupart des souches de cette espèce vivent en tant que commensaux dans l'intestin, de nombreuses souches de E. coli sont à l'origine de maladies diverses chez l'homme et l'animal. Nous avons poursuivi en 2005 différents projets en ayant un intérêt particulier pour la caractérisation des mécanismes utilisés par les bactéries pour coloniser les cellules épithéliales, l'identification de facteurs bactériens impliqués dans l'infection de l'hôte, ainsi que pour des études épidémiologiques et de génomique comparative et fonctionnelle.

Rôle des facteurs métaboliques bactériens dans la colonisation de l'hôte. (Chantal Le Bouguénec avec Laurence du Merle et Vanessa Martinez-Jehanne, en collaboration avec les partenaires d'un Programme Transversal de Recherche ; coordonnateur C. Le Bouguénec).

Des travaux préliminaires avaient révélé que de nombreuses souches de E. coli responsables d'infections rénales ont la capacité d'utiliser comme sources de carbone des sucres non métabolisés par les souches de la flore intestinale. Afin d'identifier les produits bactériens influançant la colonisation de l'intestin et du tractus urinaire de l'hôte par les souches pathogènes, nous avons réalisé une étude plus poussée des caractères métaboliques d'isolats cliniques en utilisant la technologie des microarrays phénotypiques. Les voies métaboliques d'intérêt ont été inactivées par échange allélique et les souches parentales et mutantes ont été comparées in vitro et in vivo dans des expériences de compétition quant à leurs propriétes de croissance, leur capacité à former des biofilms et à coloniser les muqueuses intestinale et urinaire de la souris.

Interaction des E. coli pathogènes avec les cellules rénales. (Chantal Le Bouguénec avec Céline Héchard-Lafleuriel et Laurence du Merle, en collaboration avec les partenaires d'un Programme Transversal de Recherche ; coordonnateur C. Le Bouguénec).

Une infection rénale à E. coli peut conduire au développement de maladies sévères avec atteintes graves des tissus et des fonctions rénales. Alors que de nombreuses études ont montré que le rôle des fimbriae de type 1 dans l'entrée et la persistance des bactéries dans l'épithélium de la vessie, l'internalisation des souches de E. coli dans l'epithélium rénal et ses conséquences sur la sévérité de l'infection n'ont pas été étudiées. Nous avons étudié l'interaction de souches responsables de pyélonéphrites avec des cellules des tubules collecteurs rénaux, le premier épithélium rencontré par les bactéries lors de leur remontée de la vessie vers le rein. Nous avons mis en évidence pour la première fois l'entrée de bactéries dans les cellules de rein.

Un projet de séquençage pour une meilleure compréhension du pouvoir pathogène des souches de E. coli. (Chantal le Bouguénec avec Vanessa Martinez-Jehnna et Laurence du Merle, en collaboration avec les partenaires du consortium Coliscope).

Nous avons proposé d'augmenter nos connaissances du pouvoir pathogène des souches de E. coli en séquençant et analysant le génome d'un isolat clinique appartenant au pathovar enteroagrégatif, reconnu comme une cause émergente de diarrhée chez les enfants et les adultes partout dans le monde.

Mots-clés: Helicobacter, gastrite, cancer gastrique, ulcère, lymphome, MALT, signalisation, acidité, peptidoglycane, muqueuse, inflammation, génomique comparative, protéomique, régulation, uréase, nickel, adhésion, invasion, métabolome, Escherichia coli


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