Unité: Biologie des Interactions Cellulaires - CNRS URA 2582

Responsable: DAUTRY-VARSAT Alice

Les travaux de l'unité portent sur : 1) l'endocytose, le trafic intracellulaire et la signalisation de récepteurs de cytokines; 2) les mécanismes d'entrée et de développement de Chlamydia, bactéries intracellulaires responsables principalement de pneumopathies, de maladies sexuellement transmises et de cécités.

1. DYNAMIQUE DES RECEPTEURS ET TRAFIC INTRACELLULAIRE

(F. Gesbert, N. Sauvonnet)

Les récepteurs membranaires reconnaissent leur ligand extracellulaire et cette interaction est suivie d'un regroupement de récepteurs à la membrane puis de l'endocytose du complexe ligand-récepteur. Les récepteurs et ligands sont alors soumis à différentes étapes de tri dans les compartiments membranaires. Par ailleurs, les processus d'endocytose conduisent à des modifications d'expression, de fonction et de localisation des composants membranaires.

Les travaux de l'unité portent sur l'endocytose, le trafic intracellulaire et la signalisation de récepteurs de cytokines. Des travaux sur le trafic du récepteur à l'antigène ont été initiés dans cette unité par le groupe d'Andrés Alcover . Les résultats concernant ces travaux sont dans le rapport de l'Unité de Biologie cellulaire des lymphocytes, crée en 2005 et dirigée par Andrés Alcover.

Les voies d'endocytose

Le mécanisme d'endocytose le mieux connu est celui qui implique d'abord la localisation des récepteurs dans des régions particulières de la membrane plasmique, les puits recouverts de clathrine. Ceux-ci se creusent pour former des vésicules intracellulaires qui transportent les complexes récepteur-ligand. Celles-ci fusionnent ensuite avec des compartiments membranaires intracellulaires, les endosomes. Après avoir identifié l'interleukine 2 (IL-2) comme le premier ligand physiologique internalisé dans les lymphocytes par une nouvelle voie d'endocytose indépendante de la clathrine, nous avons étudié la voie d'endocytose du récepteur γc.

Le récepteur γc fait partie de la famille des récepteurs de cytokines, partagé par les récepteurs de l'IL-2, l'IL-4, l'IL-7, l'IL-9, l'IL-15 et l'IL-21. Nous avons montré que d'endocytose du récepteur γc est indépendante de la clathrine par interférence ARN contre la clathrine et à l'aide de mutants dominants négatifs de la protéine Eps15. D'autre part, cette voie nécessite la polymérisation d'actine et implique la protéine GTPase dynamine. La dynamine est donc impliquée dans la régulation des voies dépendantes et indépendantes de la clathrine

Sachant que la dynamine interagit avec plusieurs protéines se liant à l'actine, nous avons recherché l'implication de ces partenaires dans l'entrée du récepteur γc. Nos résultats montrent que sur les quatre partenaires de la dynamine testés, seule la cortactine est nécessaire à l'endocytose du récepteur γc.

Ce travail nous a permis pour la première fois de caractériser une voie indépendante de la clathrine, qui, de plus, est empruntée par des récepteurs de la famille des cytokines. Nous proposons de définir un " module minimum " liant l'endocytose au cytosquelette d'actine et qui implique la dynamine, l'actine et la cortactine.

Le tri intracellulaire des récepteurs internalisés : rôle de l'ubiquitination

Après avoir atteint les endosomes, les récepteurs de l'IL2 sont triés pour être acheminés vers les lysosomes où ils sont dégradés. Nous avons observé que la chaîne β du récepteur est modifiée par une molécule d'ubiquitine et que cette ubiquitination joue un rôle clé dans le tri des récepteurs vers les endosomes tardifs/lysosomes. La régulation de la modification par ubiquitination peut être contrôlée par un équilibre entre les activités des ubiquitine ligases et des ubiquitine hydrolases. Nous avons montré que la co-expression du récepteur γc et de l'ubiquitine ligase c-Cbl conduit à une importante diminution d'expression de γc. Au contraire, l'expression de l'ubiquitine hydrolase, DUB-2, conduit à une augmentation notable de l'expression de γc. Nous avons également observé que DUB-2 a la capacité de contrecarrer l'effet de c-Cbl, et ce d'une manière qui dépend de son niveau d'expression. Ainsi, nous avons identifié le couple d'ubiquitine-ligase/ubiquitine-hydrolase, c-Cbl/DUB-2, qui peut réguler l'expression du récepteur γ c.

2. Invasion DES CELLULES par Des bactéries INTRACELLULAIRES, LES Chlamydia

(A. Subtil, M. E. Balañá, G. Boncompain, C. Delevoye)

Les bactéries Chlamydia se développent exclusivement à l'intérieur d'une cellule-hôte. Trois espèces sont pathogènes pour l'homme et sont responsables essentiellement de pneumopathies, de maladies sexuellement transmissibles et du trachome. Les bactéries se multiplient dans un compartiment membranaire appelé inclusion, d'où elles sont capables de détourner à leur bénéfice les fonctions des cellules épithéliales qu'elles infectent. Les infections primaires sont très souvent relativement mineures, voire asymptomatiques. Les séquelles, cécité, stérilité, grossesse extra-utérine, apparaissent longtemps après l'infection. Tout le cycle intracellulaire des Chlamydia a lieu dans une vacuole délimitée par une membrane dans laquelle elles se différencient et prolifèrent (Figure 3). A la fin de ce cycle, la cellule est lysée et des formes infectieuses des bactéries sont libérées. Nous étudions les mécanismes par lesquels ces bactéries entrent dans les cellules, s'y développent et modifient les cellules-hôtes.

Etude des mécanismes moléculaires de l'entrée des Chlamydia

Le développement des Chlamydia dépend de leur aptitude à entrer dans les cellules, en particulier épithéliales, qui constituent leur cible principale. Nous nous sommes intéressés aux premières étapes de l'infection de cellules par Chlamydia (Figure 4). Nous avons montré que dans les cellules épithéliales, plusieurs évènements ont lieu dans les cinq premières minutes de l'infection. Des microdomaines membranaires riches en GM1 se regroupent au niveau des bactéries invasives, des protéines phosphorylées sur tyrosine se concentrent sur ces sites, et une intense polymérisation de l'actine a lieu. Nous avons montré que la plymérisation de l'actine est en partie contrôlée par les petites GTPases Cdc42 et Rac, qui sont activées lors de l'infection par Chlamydia.

Une autre petite GTPase, la protéine Arf6, est connue pour son rôle, au niveau de la membrane plasmique, dans le trafic membranaire et la polymérisation de l'actine. Nous avons montré que l'infection par C. caviae induit une activation rapide et transitoire de Arf6, dont l'activité est requise pour l'entrée. Un effecteur de Arf6, la phosphatidylinositol 4-phosphate 5-kinase, et son produit, le phosphatidylinositol 4,5-biphosphate, s'accumulent aux sites d'entrée et sont nécessaires à l'internalisation des bactéries. A l'inverse, l'activité de la phospholipase D, un autre effecteur de Arf6, n'est pas requise pour l'internalisation de C. caviae. Enfin, nos résultats suggèrent que lors de l'entrée de Chlamydia, l'activité de Arf6 joue sur le contrôle de la polymérisation de l'actine plutôt que sur le recrutement de membrane aux sites d'entrée.

Etude systématique pour l'identification de protéines sécrétées par un mécanisme de type III

L'inclusion est un compartiment membranaire dont la taille augmente très rapidement au cours de l'infection (Figure 5). Cette membrane contient des lipides qui proviennent de la cellule-hôte. Elle reçoit également des protéines qui proviennent des bactéries qui prolifèrent à l'intérieur de l'inclusion. Nous avons démontré que les Chlamydia utilisent un système de sécrétion commun à différentes bactéries pathogènes pour sécréter des protéines à travers la membrane de l'inclusion. Nous avons ensuite entrepris d'identifier, parmi les gènes de fonction inconnue codés par le génôme de C. pneumoniae, ceux codant pour des protéines sécrétées. Nous nous sommes intéressés dans un premier temps aux protéines présentes à la fois chez C. trachomatis et C. pneumoniae, susceptibles de remplir des fonctions conservées chez ces bactéries. Cette approche nous a permis d'identifier 24 protéines candidates à être sécrétées. Il est très probable que ces protéines jouent un rôle important dans la pathogénicité des Chlamydia et nous étudions actuellement leur fonction.

L'une de ces protéines, IncA, qui se trouve dans la membrane de l'inclusion, au contact du cytosol, a été particulièrement étudiée. Lorsqu'on exprime expérimentalement la protéine IncA dans une cellule hôte, le développement de l'inclusion est inhibée et cette inhibition n'est pas observée dans le cas où l'on utilise une souche de C. trachomatis qui n'exprime pas IncA. Lorsque IncA est exprimée dans la celle hôte, elle se trouve dans le réticulum endoplasmique. Sachant que la protéine IncA s'auto-associe, ceci montre que l'inhibition observée requiert des interactions entre molécules IncA dans l'inclusion et dans le réticulum endoplasmique. Par ailleurs, nous avons modélisé les tétramères de IncA en nous appuyant sur la structure du complexe SNARE, une structure conservée impliquée dans la fusion membranaire dans les cellules eucaryotes. Notre hypothèse de travail est que les protéines IncA aient co-évolué avec la machinerie des complexes SNARE et soient impliquées dans des phénomènes de fusion membranaire.

Chlamydia pneumoniae et atherosclérose : études cliniques

De nombreuses données suggèrent que C. pneumoniae pourrait être impliquée dans l'athérosclérose. Pourtant, ce rôle éventuel est encore mal établi et la question se pose de savoir si réellement ces bactéries jouent un rôle dans le développement de la maladie. Nous avons mis au point une méthode diagnostique nouvelle, non invasive, qui permet de détecter la présence d'ADN bactérien dans des plaques d'athérome. Des ballons d'angioplastie sont récupérés après dilatation. L'ADN est extrait à partir de ce matériel et une PCR nichée permet ensuite de détecter la présence d'ADN de C. pneumoniae. Nous avons trouvé que dans les plaques de 40 % des patients atteints d'athérosclérose, on trouve de l'ADN de C. pneumoniae, alors que cet ADN n'est pas detecté dans les ballons provenant de patients non atteints d'athérosclérose. De plus, il existe une corrélation entre la gravité de la maladie et la présence de C. pneumoniae dans les plaques d'athérome. Notre méthode représente un outil nouveau pour l'étude du lien entre l'athérosclérose et les infections, à des étapes du développement de l'athérosclérose antérieures à celles observées précédemment.

Légendes des photos :

Figure 1. Dynamique et trafic intracellulaire des récepteurs membranaires. Les récepteurs membranaires à la surface cellulaire peuvent être internalisés vers des compartiments membrannaires intracellulaires (endocytose). Puis, ils subissent un processus de tri, pouvant retourner vers la membrane plasmique (recyclage), ou être acheminés vers des compartiments de dégradationn, tels les lysosomes.

Figure 2. Modèle du lien entre l'endocytose et le cytosquelette d'actine Le cœur d'un complexe constitué de la dynamine, de la cortactine de Arp2/3 et de l'actine filamenteuse serait impliqué dans les voies dépendante et indépendante de la clathrine. La cortactine jouerait dans ce complexe un rôle central dans le mouvement des vésicules d'endocytose naissantes. D'autres facteurs impliqués spécifiquement dans l'une des deux voies d'entrée, comme l'intersectine, la syndapine ou mAbp1 dans le cas de la voie clathrine, pourraient participer au complexe.

Figure 3. Schéma du cycle de développement de Chlamydia. L'intégralité du cycle se déroule dans une cellule hôte, en 48 à 72 heures. La forme infectieuse (EB) se différencie en forme proliférative (RB) qui se multiplie puis se différencie en EB en fin de cycle.

Figure 4. Chlamydia liée à la surface d'une cellule épithéliale observée en microscopie électronique à balayage. Les bactéries sont marquées avec des anticorps couplés à des billes d'or (points blancs sur la photo). Source : M. E. Balañá, avec M. C. Prévost et S. Giroux, (plate-forme de microscopie électronique, Institut Pasteur).

Figure 5. Schéma des interactions entre les bactéries et les cellules hôtes épitheliales.

L'attachement aux cellules implique des microdomaines membranaires. Le cytosquelette d'actine est réorganisé et les bactéries entrent par phagocytose, ce qui s'accompagne de signalisation dans la cellule. Le mécanisme de sécrétion de type III se met rapidement en place. Les protéines Inc (triangles) qui sont à la membrane de l'inclusion sont des candidats intéressants qui pourraient être impliquées dans divers processus tels que: l'inhibition de la fusion de l'inclusion avec les lysosomes, la migration de l'inclusion le long des microtubules vers le centrosome, l'importation de nutriments et de lipides en provenance de la cellule hôte. D'autres protéines bactériennes sont sécrétées vers le cytosol (étoiles).

Mots-clés: Endocytose, ubiquitination, trafic intracellulaire, récepteur de cytokines, interleukine 2, petite GTPase, SNARE, Chlamydia, sécrétion de type III


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