Unité: Trafic membranaire et Pathogenèse

Responsable: Chiara ZURZOLO

Grâce à l'utilisation de techniques de pointe en microscopie et imagerie cellulaire (time laps, Fret) combinées à des techniques plus classiques de biochimie, notre laboratoire a deux objectifs majeurs :

  - comprendre les bases moléculaires du tri et de l'adressage apical des protéines GPI dans les cellules polarisées

  - caractériser l'endocytose et l'exocytose de la protéine prion normale et pathogène dans les cellules épithéliales et neuronales de façon à identifier le site intracellulaire de conversion.

La polarité est une des plus importantes propriétés des épithéliums et se manifeste par la formation de deux domaines membranaires distincts : le domaine apical et le domaine basolatéral, dont la composition en lipides et protéines diffèrent et leur assure des fonctions spécialisées. Les mécanismes responsables de la formation et du maintien de cette polarité n'ont été que partiellement caractérisés. La compréhension des mécanismes moléculaires à l'origine de la polarité cellulaire est par conséquent un objectif de première importance pour la biologie cellulaire des mammifères. Nous avons focalisé nos études sur les mécanismes d'adressage apical des protéines glypiées (protéines GPI) et le rôle des microdomaines lipidiques (ou rafts) dans le tri des protéines et des lipides au niveau du " Trans Golgi Network " (TGN). Ce travail est réalisé dans deux modèles cellulaires, les cellules épithéliales MDCK et FRT, présentant des phénotypes d'adressage différents. Dans ces lignées cellulaires, nous étudions également les mécanismes d'exocytose et d'endocytose de la protéine prion normale, PrPc, et de ses mutants pathologiques, dans le but de comprendre le rôle du trafic intracellulaire et des rafts dans la fonction et la conversion de PrPc en sa forme infectieuse pathologique (PrPsc).

Deux projets principaux sont en cours de réalisation dans mon unité :

les mécanismes d'adressage polarisés des protéines GPI vers la membrane plasmique

le trafic intracellulaire de la protéine PrPc et de ses mutants : corrélation avec les mécanismes de pathogénèse des encéphalopathies spongiformes transmissibles (EST)

Etude des mécanismes d'adressage polarisés des protéines GPI vers la membrane plasmique

Les rafts sont des microdomaines lipidiques enrichis en glycosphingolipides (GSL) et en cholesterol qui ont été proposés comme plateforme impliquée dans le transport des protéines et des lipides vers la membrane apicale. Les protéines glypiées sont en effet adressées vers le pôle apical de plusieurs cellules polarisées et associées aux rafts (ou DRM pour Detergent-Resistant Microdomains) durant leur transport entre le TGN et la membrane plasmique. Cependant, les mécanismes moléculaires à l'origine de l'association des protéines glypiées aux rafts puis le rôle de cette association dans le transport vers la membrane apicale sont mal connus et plusieurs questions restent ouvertes : quel élément détermine l'association des protéines glypiées aux rafts ? Existe-t-il différents types de rafts pour différentes protéines glypiées ? Existe-t-il un récepteur responsable du tri des protéines vers différentes vésicules de transport à la sortie du TGN ?

Dans ce projet, nous utilisons des approches microscopiques et biochimiques pour analyser le rôle des rafts dans le tri et le trafic des protéines GPI.

Pour cela nous avons déjà obtenu des clones stables issus des cellules FRT et MDCK, exprimant différentes protéines chimériques fusionnées à la GFP et étudié le transport intracellulaire de ces protéines dans les cellules vivantes, en utilisant des techniques de microscopie et d'imagerie cellulaire. Nous avons montré que la GFP possédant l'ancre GPI du récepteur au Folate (GFP-GPI) est exprimé au pôle basolatéral dans les cellules FRT et au pôle apical dans les cellules MDCK. En revanche, GFP-TM, une protéine de fusion contenant le domaine transmembranaire et cytosolique du récepteur LDL (Low Density Lipoprotein) est exprimé au pôle basolatéral dans les deux lignées cellulaires. Ces mêmes approches de microscopie et d'imagerie cellulaire dans les cellules vivantes ont été utilisées pour caractériser les cynétiques de trafic apical et basolatéral. Les protéines GFP-GPI et GFP-TM ont été bloquées au cours du processus d'exocytose dans le TGN par une incubation des cellules à 20°C. Après une ré-incubation à 37°C, nous avons pu suivre et mesurer les cynétiques d'adressage membranaires des deux protéines. Nous avons également pu mesurer la taille et la vitesse des vésicules assurant le transport de ces deux protéines entre le TGN et les membranes apicales et basolatérales dans les cellules FRT et MDCK. Ce travail, en cours de réalisation, a été effectué au CID de l'Institut Pasteur et en collaboration avec le Dr Fogarty à l'Université du Massachussets (USA).

Nous avons montré, avec d'autres laboratoires, que l'association des protéines aux rafts dépend de l'ancre GPI. Cependant, ceci n'est pas suffisant pour déterminer l'adressage apical des protéines. Nous avons proposé qu'un phénomène de concentration et de stabilisation des protéines à l'intérieur de ces microdomaines intervient dans l'adressage apical des protéines GPI. En utilisant une approche biochimique, nous avons montré que seules les protéines GPI apicales (et pas les protéines GPI basolatérales) forment des oligomères de haut poids moléculaire.

Nous avons aussi montré que l'oligomérisation se produit en même temps que l'association aux rafts, durant le trajet des protéines à travers l'appareil de golgi et que cette étape apparaît cruciale dans leur tri apical (Paladino et al, JCB 2004). Notre hypothèse est la suivante : l'oligomérisation des protéines détermine leur stabilisation dans les rafts et conduit ainsi au tri apical dans l'appareil de golgi.

Ces données récusent un récent article qui montre que les protéines GPI sont triées à la membrane apicale d'une façon indirecte, après leur arrivée à la membrane basolatérale. Cette année, nous avons montré, à la fois par une approche biochimique et une approche visuelle des cellules polarisée, que les protéines GPI-apicales sont triées par une voie directe à la membrane apicale, ce qui résout finalement un long débat dans ce domaine (ce travail est maintenant prêt à être publié (Paladino, Pocard et al, sous presse, JCB).

Afin d'analyser le rôle des ancres GPI et de la protéine dans l'étape du tri, nous avons transfecté des protéines avec différentes ancres GPI et protéines transmembranaires (TM) dans des cellules MDCK et FRT. Par des techniques de " cross-linking " et de co-immunoprécipitation, nous avons pu démontrer que deux protéines GPI différentes sont retrouvées dans les mêmes complexes, alors que les protéines transmembranaires en sont exclues. Ce fait semble être indépendant du signal d'attachement de GPI (Tivodar et al., en préparation)

Une approche parallèle pour analyser la proximité des protéines à ancre GPI à la surface de la cellule et dans le TGN (durant le tri) est l'étude par " Fluorescence Energy Resonance Transfert " (FRET). Pour cela, nous allons analyser le FRET par deux techniques différentes. La " Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy " (FLIM) avec le couple CFP /YFP, ainsi que l'étude d'anisotropie de fluorescence avec la GFP. L'an dernier nous avons préparé des constructions GFP et CFP /YFP fusionnées à différentes ancres GPI (PLAP, DAF, FR, et PrP). Nous les avons transfectées par paires et obtenu des clones stables. Nous sommes en train d'analyser par FRET et les résultats préliminaires se révèlent encourageants (Pocard et al., en préparation).

Une autre approche, initiée pour comprendre le rôle des rafts dans le tri des protéines GPI, a été l'analyse de la composition lipidique des rafts associés aux protéines à ancre GPI-apicales et basolatérales. En fait, il est possible d'expliquer les différents tris par le fait que différentes protéines GPI s'associent avec différents environnements lipidiques. Par marquage au tritium des sphingolipides et en suivant les différentes protéines avec des anticorps spécifiques, nous avons purifié les DRMs associés avec eux et analysé le contenu lipidique. Nous avons constaté qu'il n'y a pas de différences qualitatives dans la composition lipidique (sphingolipides, phospholipides et cholestérol) des DRMs associés avec les protéines GPI-apicales et basolatérales, suggérant que la différence de tri ne dépend pas des différents rafts (apical ou basolatéral). Ce résultat est en accord avec notre hypothèse selon laquelle l'affinité d'une protéine pour les domaines rafts, via son ectodomaine, aurait un rôle important dans le tri. Ce travail vient d'être soumis (Tivodar et al.).

Nous avons aussi commencé à analyser le rôle de N- et O-glycans des ectodomaines dans leur tri apical. Nous utilisons deux modèles de protéines GPI et nous testons actuellement différentes mutations et délétions pour remplacer les sucres. Ces constructions seront exprimées de façon stable dans des cellules MDCK et analysées pour leur tri, trafic, association DRM et oligomérisation (Catino et al, en préparation).

Nous avons également commencé l'analyse de la machinerie moléculaire impliquée dans le tri apical des protéines GPI, et commençons à voir le rôle des SNAREs. Nous avons établi un protocole d'interférence ARN dans des cellules transfectées de façon transitoire et stable et nous recherchons les effets de l'interférence des SNAREs (syntaxine 3 et TiVamp) sur le tri des protéines GPI (Pocard, en préparation).

Etude du trafic intracellulaire de la protéine PrPc et de ses mutants : corrélation avec les mécanismes de pathogénèse des encéphalopathies spongiformes transmissibles (EST)

Les Encéphalopathies Spongiformes Transmissibles (EST), appelées aussi maladies à Prion, sont des maladies dégénératives du système nerveux central dont l'issue est fatale quelque soit leur origine (spontanée, infectieuse ou héréditaire). Ces maladies ne seraient pas causées par des agents conventionnels, mais par un variant de conformation (PrPSc ou Scrapie) de la protéine prion normale endogène PrPC, une protéine glypiée qui réside à la surface cellulaire. Il a été proposé que la structure en hélice ade la forme endogène normale PrPC soit trans-conformée en feuillet bau contact de la forme mal repliée PrPSc. PrPSc forme des agrégats hydrophobes et est hautement résistante aux protéases. Cette propriété permet de diagnostiquer les infections à prions, mais elle est également la définition, au sens large, de l'événement infectieux à l'origine des troubles neuropathologiques des EST.

Bien qu'il soit établi que la conversion de la forme PrPC en PrPSc joue un rôle central dans la pathogenèse des EST, on ne sait toujours pas quand et où, dans la cellule, ce processus intervient. Nous sommes convaincus que la conversion de la PrPC normale en sa forme pathogène PrPSc est fortement influencée par le trafic intracellulaire de la protéine. Les cellules épithéliales sont très similaires aux cellules neuronales, mais leur trafic intracellulaire (endocytose et exocytose) est mieux caractérisé. Elles représentent donc un modèle idéal pour étudier le trafic intracellulaire de la protéine PrPC et de ses mutants. De plus, dans les cellules issues de neuroblastome, PrPC est associé aux microdomaines membranaires insolubles au TX 100 et une déplétion en cholestérol réduit la dégradation de PrPC et inhibe la formation de PrPSc. Nous avons montré qu'après extraction au TX 100 à 4°C, PrPC est majoritairement insoluble. Sachant que PrPC est adressé au pôle basolatéral des cellules FRT et MDCK, ce résultat indique qu'une association aux DRM (Detergent Resistant Microdomains) n'est pas suffisante pour permettre un adressage apical des protéines GPI. Nous avons caractérisé l'association de PrPC au DRM par des expériences de radiomarquage en " pulse chase " et montré que des isoformes immatures de PrPC sont associés au DRM à un stade précoce de l'exocytose : dans le réticulum endoplasmique (RE). Après déplétion du contenu en cholestérol des cellules, nous avons perturbé l'association de PrPC aux DRM, ce qui a entraîné un mauvais repliement de la protéine, suggérant qu'une association de PrPC aux DRM est nécessaire au repliement de la protéine prion (Sarnataro et al, 2004). Sachant que les TSE résultent d'un mauvais repliement de la protéine prion, ce résultat semble pertinent dans la compréhension des mécanismes à l'origine du mauvais repliement.

Nous avons récemment testé l'association aux DRMs ainsi que les effets sur le repliement des différents mutants PrP. Nous avons montré que le mutant A182T semble être fortement associé aux DRM dans le réticulum endoplasmique. En utilisant différentes drogues affectant le cholestérol et le contenu intracellulaire sphingolipidique, il apparaît que le mutant et les protéines sauvages  (wt) résident dans différents domaines membranaires. Par conséquent, nous analysons la composition lipidique des DRMs associés à des formes normales et mutées de PrP dans les DRMs. Les résultats préliminaires indiquent qu'il n'y a pas de différences qualitatives entre les deux formes de PrP. Nous mettons en place une approche par résonance de fluorescence après photoblanchiement (FRAP) pour définir l'environnement membranaire de PrPc et des mutants PrP. Pour cela nous avons construit des mutants PrP couplés avec des protéines fluorescentes et nous sommes en train d'étudier leurs caractéristiques après photoblanchiement (Campana, en préparation).

Nous avons aussi analysé l'exocytose d'un simple et d'un double mutant de glycosylation ainsi que d'un mutant sans ancre GPI. De façon intéressante, le mutant de glycosylation A182T, qui est pathologique (trouvé dans les formes habituelles de CJD) s'accumule dans le réticulum endoplasmique où il s'associe aux DRMs. Nous avons constaté que ce mutant, présentant un problème de conformation, est dégradé partiellement par le Protéasome. Cependant, le Protéasome n'est pas impliqué dans la dégradation de la forme présentant un problème de conformation (scrapie) du mutant, qui s'accumule lorsque son association aux DRMs est perturbée. Nous suggérons, par conséquent, un rôle protecteur des rafts contre d'éventuels problèmes de conformation des protéines PrP sauvages et pathologiques (Campana et al., 2005 ; Campana et al, soumis).

Durant cette année, nous avons identifié la localisation intracellulaire de PrPSC dans les cellules neuronales infectées (N2a et GT1) et nous avons commencé à établir des lignées cellulaires primaires (cortical et neurones DRG) afin d'étudier le trafic et la localisation de PrPC dans les cellules neuronales (Casanova et Schifff).

Nous essayons également d'infecter des cellules FRT et MDCK, dans lesquelles nous avons caractérisé le trafic de PrPC. Nous mettons en place les meilleures conditions pour cette infection et la meilleure lignée cellulaire à infecter pour essayer d'identifier le site de conversion. Afin de poursuivre ces études et d'essayer d'identifier le site de conversion dans les cellules vivantes, un microscope à fluorescence avec une caméra CCD seront installés dans le laboratoire P3. En parallèle, nous avons préparé et co-transfecté des constructions couplées à la CFP et la YFP dans des cellules FRT afin d'étudier s'il y a un effet de la forme mutante sur le trafic normal ou la conformation.

Nous avons aussi progressé dans la compréhension de la voie d'internalisation suivie par PrP. Il a été montré que PrPC peut être internalisé soit via la voie clathrine dépendante ou via les caveolaes. Suite à l'endocytose, PrPC est recyclé à la surface cellulaire après " processing ". L'étude du lieu de recyclage est intéressante car elle peut indiquer l'endroit où la conversion de PrPC en PrPSc a lieu et de plus une des fonctions physiologiques de PrPc pourrait être de faciliter l'internalisation d'un ligand extracellulaire non-identifié, par analogie avec les récepteurs responsables dans l'internalisation de la tranférine et du LDL.

Pour tester l'implication de caveolaes et des puits recouverts de clathrine dans l'endocytose des isoformes de PrPC, nous avons utilisé des cellules FRT qui n'expriment pas la caveoline et n'ont pas de caveolaes, ainsi que des cellules FRT transfectées avec cav1 qui forment des caveoles.

Nous avons trouvé que PrPc est internalisé dans toutes les lignées cellulaires, principalement le long de larges invaginations non recouvertes.

Nous avons aussi constaté que l'internalisation de PrPcest ralentie par caveoline 1, suggérant un rôle pour cette molécule en tant que régulateur négatif d'internalisation. En utilisant la réduction de cholestérol, nous avons trouvé que l'internalisation de PrPc est dépendante des rafts. Toutefois, l'internalisation de PRPc n'est pas complètement bloquée par la diminution de cholestérol, suggérant qu'un autre mécanisme (raft-indépendant) est impliqué. Aussi, nous avons analysé l'implication de différents facteurs (Dynamin II, EPS15 et CDC42) impliqués dans " clathrin-dépendant " et l'endocytose indépendante. En utilisant des mutants dominant négatifs couplés à la GFP et une approche biochimique, nous avons montré que deux voies (raft-dépendant et clathrin-dépendant) sont impliquées de façon concomitante lors de l'internalisation de PrPc. Ce travail est maintenant prêt à être soumis (Sarnataro, Casanova et al).

Mots-clés: trafic intracellulaire, rafts, tri des protéines, prion, site de conversion


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