Unité: Retrovirologie Moléculaire

Responsable: WAIN-HOBSON Simon

L'Unité travaille autour de cinq projets dans les domaines suivants :

Immunopathologie du VIH, vaccination et mutation.

1. Mécanisme des hypermutations rétrovirales de type G->A induites par les membres de la APOBEC3

Rodolphe SUSPENE, Myrtille RENARD, Vincent PETIT, Michel HENRY, Denise GUETARD, Jean-Pierre VARTANIAN

La Protéine Vif de VIH-1 bloque l'incorporation d'APOBEC3G et 3F dans les particules virales. APOBEC3G et 3F appartiennent à un locus localisé sur le chromosome 22 et comprenant 7 gènes (APOBEC3A, 3B, 3C, 3DE, 3F, 3G et 3H) .

Nous venons de mettre au point un système d'amplification par PCR permettant de sélectionner spécifiquement des séquences hypermutées de type G->A. Cette technique basée sur la température de dénaturation, nous a permis d'obtenir des hypermutations in vitro au sein de différents systèmes viraux comme HBV, HTLV, les Foamy Virus et VIH-1 en présence des APOBEC3B, 3C, 3F et 3G. Ces hypermutations ont été également obtenues chez des patients infectés pour VIH-1 et HBV. Nous analysons actuellement in vitro et in vivo l'influence des APOBEC 1, 2 et 3 murins sur le virus de la leucémie murine de Friend. Nous trouvons également la présence d'hypermutation de type C-> U de façon extensive et monotone. Ces analyses nous suggèrent que l'éditing peut se réaliser soit sur des matrices ARN soit sur des matrices ADN principalement au cours de la synthèse du brin d'ADN (+).

Ces données nous montrent que la plupart de ces cytidines désaminases humaines et murines sont fonctionnelles et désaminent dans des contextes nucléotidiques différents.

2. Stoechiométrie de l'infection par VIH-1 ex vivo et in vivo

Rodolphe SUSPENE, Michel HENRY, Denise GUETARD et Jean-Pierre VARTANIAN

L'analyse par hybridation in situ par fluorescence (FISH) des splénocytes de 2 patients à différentes étapes de la maladie a montré qu'environ 75 à 80% des cellules infectées in vivo possèdent plus de 2 provirus, avec une moyenne de 3-4 copies provirales par cellule. L'analyse des populations virales après microdissection par laser des noyaux cellulaires possède une très grande hétérogénéité et les séquences obtenues montrent que ces virus VIH-1 sont génétiquement différents avec 29% de variation en acides aminés dans la région hypervariable V1-V2 de l'enveloppe virale. Il ressort de cette hétérogénéité virale la présence de virus mosaïques issus de recombinaisons multiples.

En utilisant des inhibiteurs du protéasome ainsi que de la voie endosomale/lysosomale, nous avons montré qu'une cellule in vivo est susceptible d'être infectée par au moins 300-400 virus génétiquement différents dont très peu seront intégrés et transcriptionellement actifs. Le mécanisme de cette intense variabilité obtenue au niveau d'une cellule reste à être établie. Cette étude permettra dans son ensemble de comprendre la genèse de cette intense variabilité avec notamment la présence de virus recombinants obtenue au niveau de la cellule.

3. Recherche d'une nouvelle forme d'atténuation du virus SIV, par échange de promoteur.

Nicole CHENCINER, Philippe BLANCOU, Vincent PETIT et Denise GUETARD

Parmi tous les immunogènes VIH/SIV obtenus par délétion de segments de gènes, seuls quelques vaccins vivants atténués protègent contre une épreuve intraveineuse par un isolat pathogène du SIV. L'échange du promoteur SIV par un autre promoteur viral ou cellulaire peut conférer de nouvelles propriétés au virus chimérique , telle que l'atténuation de la virulence. Si l'expression virale est déplacée vers d'autres types cellulaires (macrophages ou cellules dendritiques) que les lymphocytes T CD4+, l'aide apportée au système immunitaire pourrait aider à contenir l'infection. Nous avons principalement travaillé sur un virus chimérique dans lequel la région core du promoteur SIV située en 3'de nef et en 5' de TAR a été remplacée par le promoteur précoce du cytomégalovirus humain (CMV-IE). Le virus chimérique obtenu (SIV mégalo) pousse à bas titre in vivo -la médiane des titres de virémie sur 15 animaux est < 1000 copies /ml. Cela représente une réduction de 1000 fois du pic de virémie du virus parental. Lors d'épreuve par le virus pathogène SIVmac251, la virémie est 1000 fois inférieure à celle des contrôles naïfs (Blancou et al., J. Virol., Février 2004). Ces résultats confirment que le changement de promoteur peut atténuer le virus obtenu. Un suivi des singes infectés à long terme est réalisé pour déterminer la nature de la réponse immune induite, les lieux de réplication du virus et son évolution.

Une nouvelle approche vaccinale fondée sur la production d'antigènes à long terme par l'épithélium des muqueuses du tractus génital est en cours d'étude. A cette fin, le promoteur LTR du clone moléculaire SIVmac239 a été changé par le promoteur du gène de l'involucrine qui est une protéine s'exprimant dans les couches superficielles des épithélium pluristratifiés. Ainsi la préparation vaccinale administrée à des Souris dans un premier temps par voie intradermique ou intravaginale s'intégrera dans les cellules souches de l'épithélium muqueux, mais étant sous la dépendance du promoteur de l'involucrine, n'exprimera les antigènes viraux que dans les couches superficielles des épithélium muqueux. Une telle stratégie devrait permettre le maintien des cellules ayant intégré la construction au niveau de la couche basale de l'épithélium alors que les cellules superficielles exprimeront et présenteront les antigènes viraux aux cellules de Langherans déclenchant une réponse immunitaire localisée au niveau des muqueuses. Les constructions moléculaires ont été réalisées et la caractérisation des virus produits est en cours.

4. Le promoteur du VIH-1 joue un rôle important dans la dynamique de colonisation de différents compartiments tissulaires de l'hôte.

Mireille CENTLIVRE, Marie MICHEL et Monica SALA-SCHAEFFER

Dans une étude publiée dans Journal of Clinical Investigation en 2005 (115 ; 348-358), nous avons montré in vivo que le polymorphisme des promoteurs sous-typespécifiques du VIH-1 se traduit par des phénotypes différentiels marqués de la réplication virale dépendants de l'environnement tissulaire dans lequel le virus se réplique. Pour développer cette étude, nous avons construit des virus chimères VIS dans lesquels le génome VIS porte les fonctions Nef et LTR dissociées (STR), ainsi que des promoteurs ciblés : le promoteur minimal des sous-types B, C et E du VIH-1. Ces chimères ont été caractérisées in vitro par des cinétiques de réplication et de compétition. Puis, deux macaques Rhésus ont été co-infectés avec les trois chimères et les paramètres classiques de suivi de l'infection par VIS ont été déterminés sur huit mois. Les données obtenues ont montré que dans les rPBMC (peripheral blood mononulcear cells) et dans les ganglions périphériques, le provirus prédominant est le virus STR portant le promoteur du VIH-1 de sous-type B (STR-B). En revanche, les virus présents dans le sang circulant sont majoritairement les STR-C et STR-E. Nous avons analysé la distribution des chimères dans les ganglions lymphatiques périphériques aux semaines 10, 22 et 31 après infection et nous observons une prédominance du STR-B. Lors du sacrifice, nous avons pu analyser la distribution des différentes chimères STR dans de nombreux types de tissus lymphoïdes secondaires et non-lymphoïdes. Nous avons ainsi pu mettre en évidence que, bien que le virus STR-B prédomine dans tous les tissus analysés, le STR-C et, de façon plus faible, le STR-E persistent dans tous les organes.

Dans une étude successive, sous presse dans AIDS 2006, nous avons co-infecté deux nouveaux macaques Rhésus avec les trois virus chimères STR-B, STR-C, et STR-E et sacrifié ces deux animaux 18 jours post-infection, afin de déterminer la source principale de production du STR-C en primo-infection. Le suivi des animaux sur 18 jours nous a permis de confirmer les résultats obtenus précédemment en primo-infection: le STR-C prédomine dans le sérum jusqu'à 18 jours post-infection tandis que le STR-B domine dans les rPBMC. L'analyse approfondie du tissu lymphoïde associé à l'intestin (GALT) et des selles nous a permis d'identifier le GALT comme la source principale de production du STR-C en primo-infection. Ces données nous ont permis de conclure que le VIH-1 de sous-type C possède un promoteur particulièrement bien adapté à une réplication dans le GALT, environnement tissulaire enrichi en IL-7. Cette cytokine est en cours d'évaluation pour une utilisation en immunothérapie anti-VIH-1 pour ces effets bénéfiques sur l'homostasie de lymphocytes T et pour sa potentialité à épuiser les réservoirs viraux. A la lumière de nos résultats, des études suplémentaires sur les effets de l'IL-7 sur l'activation de la réplication du VIH-1 de façon sous-type spécifique sont en cours dans l'Unité. L'ensemble des données obtenues a permis par ailleurs de proposer un modèle sur la spécificité des sous-types viraux dans la dynamique temporale et spatiale de colonisation des différents compartiments de l'hôte (sous presse en 2006 dans " Current Opinion in HIV and AIDS).

5. Optimisation d'un polyépitope du VIH-1 et caractérisation de la réponse cellulaire induite, à l'aide de modèles de souris transgéniques. Développement d'une nouvelle stratégie vaccinale thérapeutique anti-VIH-1 dans des plantes transgéniques.

Marie-MICHEL, Denise GUETARD et Monica SALA-SCHAEFFER

L'objectif principal de ce projet (publication soumise à Journal of Virology 2006; deux brevets en cours de finalisation) est d'améliorer quantitativement et qualitativement la réponse des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques (CTL) dirigée contre le VIH-1 chez les individus infectés. En effet, les CTL sont placés au cœur de la réponse immune dirigée contre le VIH-1. Cependant, ces CTL ne peuvent endiguer l'évolution de la maladie, ce qui suggère une déficience dans leur efficacité de lyse. Afin d'améliorer la réponse CTL chez les individus infectés, de nombreuses études ont porté sur la mise au point de polyépitopes du VIH-1 restreints aux allèles HLA de classe I, et en particulier HLA-A2.1, allèle présent dans 40% de la population mondiale. Nous avons dessiné des polyépitopes du VIH-1 optimisés tant sur le plan nucléotidique que protéique afin de favoriser leur traduction, leur adressage intracellulaire et leur présentation aux lymphocytes T CD8+. Ces polyépitopes ont été conçus afin d'être associés aux pseudo-particules virales (VLPs) formées par l'antigène de surface du HBV (HBsAg). L'efficacité d'un de ces polyépitopes dans l'induction d'une réponse immune cellulaire efficace anti-VIH-1 a été évaluée dans les modèles animaux murins HHD et HHD/DRB1. Nous avons ainsi pu montrer que par le processus d'optimisation du polyépitope, il est possible d'obtenir en culture une sécrétion accrue de VLPs et in vivo une augmentation de l'état d'activation globale des lymphocytes T spécifiques du VIH-1.

Sur la base de ces résultats, en collaboration avec l'Université de Milan (Italie) et l'INRA de Versailles, nous développons des plantes transgéniques exprimant le polyépitope du VIH-1 optimisé fusionné à l'HBsAg et testé dans les modèles murins pour son immunogénicité. Il existe actuellement dans le commerce des vaccins recombinants produits dans des organismes transgéniques tels que des bactéries, des levures et des lignées cellulaires de mammifères (exemple : vaccin contre l'HBV). Au vue des avancées biotechnologiques réalisées dans la mise au point de plantes transgéniques, celles-ci pourraient être également utilisées dans la production de dérivés immunogènes intégrés dans des produits végétaux comestibles tels que les fruits, des extraits de plantes ou des protéines purifiées, permettant ainsi leur administration par voie orale. Cette voie d'administration permet l'induction d'une réponse immunitaire au niveau des muqueuses et tout particulièrement du tissu lymphoïde associé à la muqueuse intestinale (GALT, Gut Associated Lymphoid Tissue). Le GALT contient 80 % des lymphocytes T CD4+ mémoires activés de l'individu, répartis entre la lamina propria et l'épithélium. Leur porcentage y est donc bien plus importante que dans le sang périphérique et les organes lymphoïdes. Dans la mesure où ce compartiment est un des sites préférentiels d'infection et de réplication du VIH-1, il est nécessaire de cibler ce tissu par un vaccin préventif et thérapeutique. Nous avons pris le pari d'atteindre cet objectif en élaborant un protocole d'immunisation par voie orale via l'administration de plantes trangéniques exprimant des VLPs recombinantes qui portent à leurs surfaces des polyépitopes du VIH-1.

Mots-clés: VIS, VIH, vaccin, infections multiples, APOBEC3, deamination cytidine


Rapports d'activité 2005 - Institut Pasteur
filet

Debut de Page recherche Portail Institut Pasteur

En cas de problèmes, de remarques, ou de questions concernant cette page Web écrire à rescom@pasteur.fr