Unité: Régulation de la traduction eucaryote et virale - CNRS URA 1966

Responsable: KEAN, Katherine M.

La régulation de l'expression génétique au niveau de la synthèse protéique (traduction) est un phénomène d'une grande importance. On définit aussi bien une modulation globale, selon les conditions environnementales, qu'une régulation spécifique, par l'utilisation de mécanismes variants et alternatifs pour la traduction des sous populations d'ARNm. Des exemples clairs de régulation spécifique de la traduction sont fournis par le changement abrupt du profil de la synthèse protéique dans des cellules infectées par de nombreux virus : le pathogène subvertit la machinerie cellulaire de la traduction à son propre profit, au dépens de la majorité des ARNm cellulaires. Les objectifs généraux de notre recherche sont dirigés vers l'étape de l'initiation de la traduction, particulièrement le contact initial entre la sous-unité ribosomique 40S et l'ARNm. Notre but est de mieux comprendre les mécanismes moléculaires de la synthèse protéique par le ribosome eucayote et la régulation de la traduction selon la structure de l'ARN et lors de l'infection par des virus à ARN.

1) Etude de la traduction du virus de l'hépatite C

Le génome ARN (+) du virus de l'hépatite C (HCV) présente des régions non traduites 5' et 3' longues, structurées et conservées parmi différentes souches. En particulier, à la différence d'un ARNm cellulaire classique, la région 5' comporte un IRES (Signal d'Entrée Interne des Ribosomes) et l'extrémité 3' terminale une structure de 98 nucléotides en forme de feuille de trèfle, notée X, au lieu d'une queue poly(A). Notre hypothèse de base était que PTB (Polypyrimidine Tract Binding protein) fixé normalement sur la région X ainsi que sur l'IRES du HCV sert de lien afin de favoriser une pseudocircularisation de l'ARN et par là-même une traduction plus efficace. Ceci serait l'analogue du modèle proposé pour l'ARNm classique, coiffé et polyadenylé, où un pontage mRNA5'-eIF4E-eIF4G-PABP-mRNA3' est impliqué dans l'initiation de la traduction efficace dans des conditions compétitives. L'hypothèse suppose une stimulation de l'efficacité de la traduction à partir de l'IRES de l'HCV mediée par la région X.

Effectivement, depuis quelques années nous avons trouvé une telle stimulation de l'efficacité de la traduction médiée par la région X, mais ce sujet reste discuté. Des publications de différents groupes concernant les effets de X sur la traduction décrivent soit une stimulation, soit l'absence d'effet, ou même une inhibition. Ainsi, nous avons construit un plasmide de traduction témoin dans lequel la séquence X se trouve dans l'orientation antisens. Les ARN produites montrent des propriétés fonctionnelles identiques à celles des ARN témoins négatifs délétés de la région X à leur extrémité 3'. Donc, dans nos conditions expérimentales, la stimulation traductionelle par la région X en 3' de l'ARN est un effet spécifique, et il semble que cet effet soit modulé par la séquence exacte de l'IRES. Maintenant, nous avons également installé un test RT-PCR spécifique et semi-quantitatif, qui nous a permis de vérifier que des stabilités différentielles des différents ARN n'interviennent pas dans l'effet observé de la région X. Précédemment, nous avons décrit l'étude des IRES variants qui sont distingués de la stimulation par la région X à l'extrémité 3' de l'ARN vu pour l'IRES prototype : étant ou bien réfractaires à X ou bien inhibés par cette séquence. Un des variants de génotype 3a qui demeure insensible à la région X diffère du prototype par une substitution G en A en position 243. Ceci est l'une des 4 variations entre les séquences des IRES extrêmement apparentés des génotypes 1a et 1b du HCV. Ainsi, nous avons pensé que de telles différences mineures de séquence entre les souches étudiées par différents groupes pourraient expliquer les controverses rapportées quant à l'effet de la région X sur l'efficacité de la traduction. Nous avons construit par mutagenèse dirigée un certain nombre d'IRES chimères type 1a/1b qui recouvrent les résidus différentiels entre les deux souches. Aucune position n'a pu être clairement identifiée comme responsable des contradictions dans les effets de la région X décrits jusqu'à maintenant.

Par mutagenèse dirigée, nous avons reconstruit des mutants dans des boucles de la région 3' X de l'ARN qui devraient être défectueux pour la fixation de PTB. EMSA (ou test de changement de mobilité), a permis de démontrer qu'un mutant altéré dans la séquence de la boucle 2 fixe la protéine PTB recombinante un peu moins bien que le fait la séquence X prototype. En revanche, un mutant altéré dans la séquence de la boucle 3 est fortement handicapé pour la fixation de PTB. Cependant, lorsque les ARN porteurs de ces régions X mutants ont été testé en traduction in vitro, c'était le mutant de la boucle 2 qui s'est avéré fortement handicapé fonctionnellement, se comportant comme un ARN sans séquence X à l'extrémité 3'. Quant à lui, le mutant altéré dans la séquence de la boucle 3 était capable de stimuler l'efficacité de la traduction à partir de l'IRES du HCV aussi bien que la séquence X sauvage. Donc, il semble peu probable que la fixation de PTB à la région X intervienne dans la stimulation traductionelle mediée par X. Afin de confirmer cette conclusion, nous voulions effectuer des traductions dans des extraits deplétés pour PTB par passage à travers une colonne d'affinité du domain I de l'IRES du virus de l'encéphalomyocardite comme déjà décrit. La technique a présenté des inconvénients importants. D'abord relativement peu d'extraits pourraient être préparés aisement, et la préparation est coûteuse. Par ailleurs, la dépletion n'est pas totalement spécifique. A ce jour, nous trouvons que les résultats utilisant ce système de traduction ne sont pas totalement satisfaisants, et nous poursuivons des expériences pour confirmer nos données préliminaires.

2) Etude du synthèse de la protéine M du virus de la rage (coll. Y.Jacob, Departement de Virologie)

Il est connu que la protéine de matrice (M) du virus de la rage diminue la transcription virale tout en stimulant la réplication virale. Utilisant un criblage double hybride de la levure avec une banque de cADN de cerveau humain, nous avons identifié la sous-unité h (anciennement p40) du complexe eIF3 comme partenaire cellulaire de la protéine M du virus de la rage. Cette interaction a été confirmée par co-immunoprécipitation des deux protéines. Nous avons poursuivi nos études pour mieux comprendre la régulation de la traduction de M et le rôle de l'interaction M-eIF3h. Nous avons purifié la protéine M exprimée dans des cellules eucaryotes et montré que la protéine M ajoutée en trans inhibe la traduction in vitro sur des ARNm qui contiennent des régions 5' noncodantes classiques (Kozakiens). De façon remarquable, dans certains cas, l'inhibition est observée à des ratios environ équimolaires de protéine/ARNm. En revanche, la traduction d'un ARN qui contient l'IRES du virus de l'hépatite C n'est pas affecté par la protéine M. L'IRES du HCV a la particularité de ne pas avoir besoin d'eIF3 pour le recrutement du sous-unité 40S ribosomale. Après transfection des cellules eucaryotes en culture, la protéine M pourrait être trouvé dans la sous-fraction polysomale de la cellule, et il semble que ceci inhibe l'association polysomale d'une protéine témoin co-transfectée en parallèle.

Mots-clés: virus à ARN, Initiation de la traduction, IRES, ARN structure-fonction, co-opération ARNm 5’-3’


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