Unité: Régulations Transcriptionnelles

Responsable: Annie Kolb

Notre objectif est de caractériser les modifications de l'expression génétique en réponse aux carences et aux stress. σS, le facteur σ de phase stationnaire de l'ARN polymérase, codé par le gène rpoS, joue un rôle clef dans la survie en phase stationnaire, la réponse généralisée au stress et la virulence. Nos études portent sur l'expression et la fonction du régulon rpoS chez Salmonella avec la caractérisation de mutants de gènes sensibles à σS, l'identification de facteurs modulant l'expression ou l'activité de σS et l'étude mécanistique de la reconnaissance des promoteurs dépendant de σS.

Le facteur σS de l'ARN polymérase

L'ARN polymérase est responsable de la première étape de l'expression des gènes et la cible de nombreuses régulations. L' holoenzyme bactérienne comprend l'enzyme coeur E et un facteur σ qui permet la reconnaissance des promoteurs et le démarrage de la transcription. Les entérobactéries Escherichia coli et Salmonella enterica possèdent 7 facteurs σ qui entrent en compétition pour la fixation à l'enzyme cœur. σ70 assure la transcription pour toutes les fonctions essentielles de la cellule. A l'entrée en phase stationnaire et en réponse à de nombreux stress, apparaît le facteur σS, appelé aussi σ38. σS contrôle la transcription de quelques centaines de gènes impliqués dans la survie en phase stationnaire, la résistance aux variations de pH, au choc osmotique et au stress oxydatif, le développement des biofilms et la virulence. Jusqu'à aujourd'hui, la fonction exacte de presque la moitié des gènes régulés par σS est inconnue.

Analyse fonctionnelle des gènes du régulon rpoS chez les salmonelles (F. Norel, V. Robbe-Saule)

σS est essentiel à la virulence et la persistance de Salmonella enterica sérotype Typhimurium, un pathogène intracellulaire facultatif qui cause des maladies sévères chez l'homme et les animaux. Notre objectif est de mieux comprendre les fonctions du régulon rpoS dans la physiologie et le pouvoir pathogène de Salmonella et d'identifier les fonctions clés de sa survie dans l'environnement inerte et biologique. Nous avons isolé des mutants de S. Typhimurium contenant des fusions de gènes activées par σS. L'identification de ces gènes montre que la composition du régulon rpoS de Salmonella diverge significativement de celle du régulon rpoS d' E. coli K12 puisque plus d'un tiers des gènes de Salmonella ainsi identifiés est absent chez E. coli K12. Plus de la moitié des gènes identifiés ont une fonction inconnue en cours de caractérisation. Parmi ces gènes, le gène katN, absent chez E. coli K12, mais conservé chez les E. coli entérohémorrhagique O157, Klebsiella pneumoniae et Pseudomonas aeruginosa, code pour une catalase non-héminique de phase stationnaire. D'autres gènes pourraient participer au métabolisme bactérien, probablement dans des conditions de croissance sub-optimales proches de celles rencontrées dans les habitats naturels.

Modulateurs de l'activité de σS (F. Norel, V. Robbe-Saule, C.Talhouarne, H. Mahtout, N. Miroslavova)

En phase stationnaire, σS reste toujours moins abondant que σ70. L'enzyme cœur, en quantité limitante dans la cellule, a une affinité nettement plus forte pour σ70 que pour σS. Il existe donc in vivo des facteurs qui permettent à σS d'assurer la transcription des promoteurs dépendant de σS. Notre objectif est de caractériser ces facteurs sur le plan fonctionnel et biochimique.

La protéine Rsd exprimée en phase stationnaire se lie à σ70 avec une forte affinité. La constante de dissociation est de l'ordre du nM (valeur déterminée par résonance plasmonique de surface à la plateforme de Biophysique de l'Institut Pasteur). In vitro Rsd inhibe l'activité de certains promoteurs dépendant de σ70. Rsd peut dissocier l' holoenzyme Eσ70 et par conséquent favoriser indirectement l'association entre l'enzyme coeur et σS. Rsd peut aussi agir directement en favorisant la liaison σS-enzyme coeur aux promoteurs. Jusqu'ici la délétion du gène rsd n'a pu être associée à aucun phénotype et sa fonction biologique reste inconnue.

La protéine Crl se fixe à σS avec une affinité faible (Kd = 2.5 microM). Cependant elle active directement la transcription médiée par σS in vitro. Chez Salmonella, Crl est responsable du développement du morphotype "rdar" caractérisé par l'aspect "red dry and rough" des colonies sur milieu rouge Congo à faible osmolarité et faible température (Figure 1). Cet état d'agrégation multicellulaire dépend de σS et est corrélée à la formation de biofilms. La matrice extracellulaire est composée en particulier de petits fimbriae (curli) et de cellulose. Crl est nécessaire à l'expression maximale des gènes impliqués dans la biosynthèse des curli et de la cellulose (csgD, csgB, adrA et bcsA ). La trans-complémentation de la mutation crl par le gène crl cloné a lieu uniquement dans le mutant crl, mais mais non dans le mutant rpoS ou le double mutant crl rpoS, ce qui indique que le rôle de Crl requiert la présence de σS. L'expression de σS est augmentée dans le mutant crl et Crl fonctionne de concert avec σS pour permettre une transcription plus efficace de gènes dépendant de σS. L'expression de Crl est induite en phase stationnaire de croissance et précède légèrement celle de σS.

Nous cherchons également à appréhender la finalité biologique de la fonction régulatrice de Crl et de Rsd chez Salmonella par l'étude de fusions transcriptionnelles de gènes dépendant de σS et l'analyse des phénotypes (virulence, résistance au stress). En parallèle, deux approches globales, l'une phénotypique (phénotypes arrays Biolog), et l'autre protéomique, sont développées afin d'évaluer le degré de recouvrement entre les régulons Crl et RpoS

Positionnement relatif de l'ARN polymérase Eσ54 et de l'activateur au promoteur glnAp2 (Y. Huo, collaboration avec Y. Wang, Université de Pékin)

L'ARN polymérase contenant le facteur σ54 (Eσ54) se fixe sur une face de l'ADN pour former un complexe fermé, incapable de démarrer la transcription. L'activation du promoteur nécessite la présence d'un activateur lié à des séquences distales. Pour clarifier la topologie des contacts entre Eσ54 et l'activateur, nous avons introduit à différentes positions entre le site de l'activateur et le promoteur glnAp2, sans en changer la distance, des sites de fixation pour une protéine courbant l'ADN (CRPH159L ou IHF) et étudié l'activité in vivo et in vitro de ces dérivés. Le profil de régulation induit par la protéine présente la périodicité de l'hélice d'ADN. De manière inattendue, l'activation de la transcription la meilleure résulte d'un positionnement de l'activateur et de Eσ54 sur des faces opposées de l'ADN dans le complexe fermé. Ces résultats en accord avec les données de modélisation moléculaire, montrent que l'activateur doit approcher le complexe formé au promoteur par le côté libre de l'hélice d'ADN (Figure 2). Un site de fixation pour FIS, une protéine qui courbe l'ADN dans l'orientation favorable, a été mis en évidence en position -55 en amont du promoteur glnAp2 sauvage.

Un facteur sigma primaire peu commun chez les Bacteroidetes et les Chlorobi (D. Vingadassalom, collaboration avec E. Collatz et I. Podglajen, INSERM-Université Paris VI)

Les facteurs sigma majeurs étudiés jusqu'ici présentent une organisation commune comprenant 4 régions impliquées dans des fonctions spécifiques. Associés à l'enzyme coeur, ils reconnaissent deux éléments du promoteur, les hexamères -10 et -35 de séquence consensus TATAAT et TTGACA. Le facteur sigma primaire de B. fragilis (ainsi que ceux des autres membres des deux phyla) est dépourvu de région 1.1 et a une signature particulière de 29 acides aminés conservés. Il fonctionne uniquement en association avec son propre enzyme coeur et est alors capable de reconnaître les promoteurs typiques de Bacteroides dont les séquences -10 et -35 consensus sont respectivement TAnnTTTG et TTTG. L'holoenzyme de Bacteroides est incapable de transcrire les promoteurs classiques d' E. coli (lacUV5 et RNAI). Des mutants du facteur sigma de B. fragilis sont actuellement à l'étude pour identifier les principaux résidus impliqués dans la reconnaissance sélective de ses promoteurs.

Figure 1 :

Morphotypes de Salmonella ATCC14028 et de ses mutants : (1) souche sauvage, (2) ATCCcrl, (3) ATCCrpoS, (4) ATCCcrlcsgB et (5) ATCCcrlbcsA après 5 jours de croissance à 28°C sur milieu Congo rouge de faible osmolarité. ATCC14028 présente le morphotype "rdar" (red, dry and rough) alors que ATCCrpoS présente le morphotype "saw" (smooth and white). Le mutant crl présente un morphotype atypique (rdarcrl), qui est affecté par l'absence de curli dans le double mutant crl csgB et par l'absence de production de cellulose dans le double mutant crl bcsA

Figure 2 :

Modèle du complexe promoteur-activateur-holoenzyme Eσ54 (Huo et al., Mol. Microbiol., 2006, 59 :168-180). L'activateur oligomèrique est représenté sous forme d'un anneau gris. Les différentes sous-unités de l' ARN polymérase sont indiquées par des couleurs différentes :β en bleu, β' en vert, α en rouge, w en jaune et σ en violet. La structure du complexe promoteur-Eσ54 a été modélisée d'après la structure cristalline du complexe promoteur-holoenzyme EσA de Thermus aquaticus (PDB code 1L9Z)

Mots-clés: ARN polymérase, Salmonella, phase stationnaire, sigma, anti-sigma, protéine réceptrice de l’AMP cyclique (CRP), MICROBIOLOGIE MOLECULAIRE, BIOCHIMIE


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