Unité: Régulation Enzymatique des Activités Cellulaires

Responsable: Michel VERON

L'activité du laboratoire s'organise autour de deux thèmatiques : (i) L'étude des propriétés biochimiques et structurales de la protéine NEMO, élément régulateur essentiel de la voie de transduction NF-κ B et son altération chez les malades possédant un gène NEMO muté (sous la responsabilité de Fabrice Agou) et (ii) L'étude des mécanismes d'émergence de formes recombinantes chez le VIH, une source majeure de variabilité génétique chez ce virus, et l'impact de la recombinaison sur la capacité du virus à se répliquer (sous la responsabilité de Matteo Negroni).

A. Etudes biochimiques de la protéine NEMO (NF-κB Essential Modulator), un composant essentiel de la voie de signalisation NF-κB (Elisabeth Fontan, François Traincard, Jeanne Chiaravalli, Monika kaminska, Emilie Vinolo, Emmanuel Wyler et Fabrice Agou)

La plupart des cellules répondent à une grande variété de stimuli moléculaires dont les cytokines pro-inflammatoires (TNF-α et l'IL-1) et les endotoxines (LPS), en activant des gènes impliqués dans les réponses immunitaires et inflammatoires ou dans la tumorogénèse et l'apoptose. Ces gènes sont sous le contrôle des facteurs de transcription de la voie de signalisation NF-κB. L'activation de cette voie est modulée par un complexe protéique comprenant les protéines kinases IKK et la protéine régulatrice non catalytique NEMO (aussi appelée IKKγ). Nous étudions les propriétés biochimiques et structurales de NEMO et le mécanisme moléculaire par lequel il induit l'activation des kinases IKK.

La protéine NEMO est composée de plusieurs domaines formant des coiled-coils. Nous avons montré que NEMO n'est active que sous forme oligomérique et définit le domaine minimal permettant l'association des sous-unités en trimères. Celui-ci a été purifié et ses propriétés d'association ont été caractérisées par filtration sur gel, polarisation de fluorescence, dichroïsme circulaire, centrifugation analytique et protéolyse ménagée. Le domaine minimal de trimérisation de NEMO est composé des sous-domaines coiled-coil CC2 et LZ qui s'associent pour former un hétéro-trimère stable. Les études biochimiques nous ont permis d'élaborer un modèle structural de ce motif sur la base duquel nous avons conçu des peptides capables de pénétrer dans les cellules et correspondant à des portions optimisées des sous-domaines CC2 ou LZ, mimant les zones de contact entre les sous-unités de NEMO. L'internalisation de ces peptides dans les cellules a été suivie par FACS et leur effet sur l'activation de la voie en réponse au LPS a été quantifié grâce à un gène rapporteur dans des lymphocytes pré-B 70Z/3 stablement transfectés. Le peptide LZ et, à un degré moindre, le peptide CC2 bloquent, de manière spécifique, l'activation de la voie NF-κB par plusieurs stimuli pro-inflammatoires (LPS, IL-1, TNF-α) ou carcinogène (PMA) avec des IC50 de l'ordre du µM et ils induisent l'apoptose de cellules cancéreuses dans la même gamme de concentrations. Cet effet est dû à l'inhibition de l'oligomérisation de NEMO qui a été examinée tant in vitroqu'ex-vivo dans les cellules en culture. Récemment, nous avons isolé, en utilisant la méthode d'évolution dirigée "Ribosome Display" (RD), une nouvelle famille d'ankyrines affines pour le domaine d'oligomérisation. Les protéines ankyrines constituent une famille de protéines formant une architecture modulaire qui est thermodynamiquement stable et impliquée dans diverses interactions protéine-protéine. Après plusieurs cycles d'amplification/sélection par RD, nous avons isolé des ankyrines présentant des affinités de l'ordre du nM pour le domaine CC2-LZ. L'expression de ces dernières dans les cellules, inhibe spécifiquement l'activation du complexe IKK via une intéraction spécifique avec la protéine NEMO endogène. Ensemble, ces résultats valident le concept d'une nouvelle stratégie d'inhibition de la voie NF-κ B dans les thérapies anti-inflammatoires et anti-cancéreuses via l'altération de l'oligomérisation de NEMO.

NEMO est aussi impliqué dans deux maladies génétiques humaines liées au chromosome X, la dysplasie ectodermique anhidrotique avec immunodéficience (EDA-ID) et l'Incontinentia pigmenti (IP). Nous avons étudié la mutation A288G identifiée chez un patient EDA-ID et localisée dans le domaine d'oligomérisation de NEMO. La mutation n'altère pas l'ubiquitination de NEMO mais réduit significativement la stabilité du trimère d'après l'analyse par dichroïsme circulaire des courbes de dénaturation en fonction de la température. Les propriétés de fluorescence de la tyrosine localisée dans le domaine adjacent formant un doigt de zinc (ZF) sont également altérées, problablement dû à un changement de conformation de ce domaine, ce qui suggére une interaction étroite entre le domaine d'oligomérisation de NEMO et le domaine ZF. En outre, des tests de complémentation fonctionnelle réalisés à l'aide de lymphocytes pré-B et T invalidés pour le gène NEMO, ont révélé que la mutation pathogène réduit l'activation de la voie NF-κB induite par le TNF-α ou le LPS. Ces résultats ont permis pour la première fois de proposer une base moléculaire rendant compte du phénotype EDA-ID lié à des mutations de NEMO.

B. Génération et selection de formes recombinants du VIH-1 : Aspects structuraux et génétiques (Román Galetto, Etienne Simon-Lorière, Véronique Giacomoni, Cecilia Ramírez & Matteo Negroni)

La recombinaison homologue est une source majeure de variabilité chez les rétrovirus. Chez le VIH, selon le type cellulaire impliqué, on observe pas moins de trois à trente évènements de recombinaison lors d'un seul cycle infectieux. Lors de leur vie extracellulaire, les rétrovirus stockent leur information génétique sous forme d'une molécule d'ARN, présente en deux copies au sein de chaque particule virale. La recombinaison génétique est en grande majorité générée par un changement de matrices entre ces deux ARNs (transfert de brin) lors de la transcription inverse. L'impact de la recombinaison sur la dynamique des infections rétrovirales est dramatiquement illustré par la diffusion de la pandémie de SIDA. En effet, au moins 10% des souches infectieuses de VIH proviennent de recombinaisons entre différents sous-types viraux (recombinants inter sous-types). Certaines souches recombinantes inter sous-types sont très largement diffusées à travers le monde et sont appelées CRF pour Forme Circulante Recombinante.

Nous étudions les mécanismes induisant la formation de formes recombinantes en utilisant principalement un système original de cellules en culture en limitant l'infection à un seul cycle. Cette approche nous permet de caractériser les recombinants générés en absence de sélection, produisant des résultats concluants sur les mécanismes de recombinaison. A l'aide de ce système, nous avons disséqué un " hot spot  " de recombinaison dont la présence dans le gène env de l'isolat LAI corrèle avec celle d'une structure en épingle à cheveux dans l'ARN génomique. Nous avons déterminé que plusieurs paramètres contribuent à l'existence de ce hot spot et nous avons proposé un mécanisme expliquant le transfert de brins au sein de régions d'ARN génomique en épingle à cheveux. Selon ce mécanisme, le transfert procéderait d'une façon similaire à la migration de branche rencontrée lors de recombinaison ADN-ADN. Récemment, nous avons montré que dans les cellules infectées, en plus de la structure de l'ARN, la présence d'une parfaite identité de séquence locale est requise. En fait, la présence d'une seule discordance de bases entre ARN donneur et accepteur entraîne l'élimination de la région hot spot en question.

Nous étudions actuellement la recombinaison impliquant des isolats de différents sous-types du groupe M du VIH-1 en absence de pression de sélection. Une carte des formes recombinantes générées le plus fréquemment le long du gène env est en cours d'élaboration. En parallèle, nous caractérisons les protéines recombinantes générées dans ces expériences afin de mieux comprendre les étapes précoces de génération des formes recombinantes trouvées dans l'épidémie. Ces recherches visent à améliorer notre compréhension des interactions complexes entre l'évolution du virus et son adaptation à l'hôte. Sur le long terme, la capacité d'isolats divergents à induire la formation de virus chimériques fonctionnels et non fonctionnels ainsi que l'analyse des bases moléculaires induisant ces échecs pourront indiquer des contraintes structurelles utiles pour élaborer des molécules avec une potentielle activité antivirale.

Mots-clés: Signal transduction, NF-kappaB, kinase,NEMO/IKKgamma, Rétrovirus, VIH, Recombinaison


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