Unité: Synthèse d'oligonucléotides à haut débit (Plate-forme)

Responsable: Gouyette Catherine

Nous effectuons, dans notre plate-forme, exclusivement des synthèses d'oligonucléotides, mais de différents types :soit en plaques 96 puits, pour les puces à ADN et dans ce cas ce sont des oligonucléotides d'une longueur d'environ 70 bases ( purifiés sur colonnes rapides C18, vérifiés par HPLC analytique et électrophorèse capillaire), soit des synthèses effectuées " au coup par coup " d'oligonucléotides de longueur très variable, modifiés ou non, purifiés ou non par HPLC et en quantité allant de quelques unités de DO (à 260nm) à quelques milligrammes, soit des synthèses de d'ARN et de RNAi purifiés (HPLC, MALDI-TOF)

a) Tout d'abord, un bilan général de ce qui a été fait cette année en format plaque 96 pour les projets retenus par le comité de pilotage de la Génopole  et autres :

- Dans le cadre du projet de développement de puces dédiées à l'analyse des profils d'expression des microARNs (C.Antoniewski), les oligos doivent être spottés sur un type de lame avec une chimie différente et être modifiés par un groupement amine, soit à l'extrémité 5'ou en 3'. Dans un premier temps nous avons fait environ 40 oligos ( de 50 bases) aminés en 5' pour s'accrocher à la lame et où la partie de la séquence qui doit s'hybrider se trouve à l'extrémité 3', donc éloignée de la lame. Nous avons aussi fait les mêmes 40 oligos où cette fois,la partie qui s'hybride (25bases) est en 5' et les nucléotides espaceurs (35 bases) ainsi que le groupement amine se trouvent en 3' : il a donc fallu faire une purification extrème par HPLC de ces oligos pour être sûrs d'avoir la partie hybridante (25bases) dans sa totalité. Nous avons aussi fait ces oligos 3'OH et 5'OH comme contrôle négatif. De meilleurs résultats ayant été obtenus avec les oligos 3' amino, nous avons par la suite fait une plaque de 96 puits complète,

Egalement, des oligos (série commencée en 2003) pour l'analyse de la virulence du parasite humain Entamoeba histolytica à l'aide de puces à ADN.

- Nous avons fait des plaques d'oligos pour Plasmodium berghei, ,Plasmodium falciparum

- plusieurs plaques 96 de primers pour la plate-forme de Séquencage PF1 (Maerugin, E.coli,Leptospires)

- des séquences en plaque 96 pour la plate-forme PF6,

etc………….

b) Comme les années précédentes,dans l'unité de Chimie Organique, avant la création de la plate-forme, nous faisions des oligonucléotides purifiés par HPLC, nous avons continué cette activité pour les besoins spécifiques de laboratoires avec lesquels nous avons toujours travaillé, tels que :

- des " molecular beacons" pour l'Institut Pasteur de Séoul, et l'unité de Biologie Cellulaire du Noyau avec différents quenchers et fluorophores.

- des oligos marqués en 5' par Cy5 ou Cy3 pour l'Institut Pasteur du Cambodge, pour l'Unité de Biologie Cellulaire du Parasitisme, pour Nadine Martinet ( CHU Nancy Cancéropôle Grand Est) à qui nous avons également fait des "molecular beacons" ,

- des ARNi pour le Laboratoire des Virus Entérotropes et Stratégies Antivirales,

- des ARN pour le G5 Génétique et Epigénétique de la drosophile, et pour le laboratoire de Physicochimie Biomoléculaire et Cellulaire,Paris XIII

- des oligos ADN ponctuellement pour différents labos de l'Institut, pour le Génescore, pour l'Itodys,Jussieu

- et enfin, des oligos ADN à l'échelle de quelques dizaines de milligrammes purifiés pour le CRSSA de Grenoble, et pour le Pr Subirana à l'Université de Barcelone avec qui nous travaillons depuis de nombreuses années,

Tous ces oligos ont été purifiés par HPLC et vérifiés par spectrométrie de masse.

Mots-clés: oligonucléotides, siRNA, séquences d’ADN modifiées, « molecular beacon »


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