Unité: Puces à ADN (Plate-forme)

Responsable: Coppee, Jean-Yves

La plate-forme a pour vocation le développement des puces à ADN pour l'étude (génomique comparée et analyse des profils d'expression) des microorganismes modèles et des maladies infectieuses (microorganismes pathogènes et réponse de l'hôte à l'infection). Elle dispose de l'équipement nécessaire à la réalisation des puces sur divers supports ainsi que de plusieurs outils statistiques et bioinformatiques pour l'analyse, l'interprétation et la gestion des résultats.

La disponibilité des séquences complètes des génomes d'un nombre croissant de microorganismes et les potentialités des nouvelles technologies d'analyse de l'expression des gènes ont incité l'Institut Pasteur à mettre en place une plate-forme destinée à la fabrication et à l'analyse des "puces à ADN ". Celle-ci a pour vocation l'étude des microorganismes modèles et des maladies infectieuses. Dans ce dernier cas, nous nous intéressons aussi bien aux agents responsables de ces pathologies (génomique comparée et analyse du transcriptome) qu'à la réponse de l'hôte (analyse du transcriptome).

Actuellement, trois technologies sont utilisées à la plate-forme:

-Microarrays: dépôts de produits PCR ou d'oligos sur lames de verre et hybridation avec des cibles fluorescentes (cyanines)

- Macroarrays: dépôts de produits PCR sur membranes en nylon et hybridation avec des cibles radioactives

- Affymetrix: utilisation de puces commerciales contenant des oligos courts synthétisés in situ et hybridation avec des cibles fluorescentes (phycoérythrine)

La plate-forme réalise des projets suite à des appels d'offre internes. Ces projets sont réalisés sous forme de collaborations. La plupart des projets retenus ont un cadre national ou européen. Le coût de fabrication et de validation des puces est pris en charge (partiellement ou totalement) par la Genopole.

Pour les macroarrays et les microarrays, la plate-forme prend en charge:

- la préparation des puces: dessin des oligonucléotides (primers PCR et oligos longs), amplifications, dépôts sur les supports, contrôle qualité des dépôts

- l'encadrement et la formation des utilisateurs pour la préparation des cibles (fluorescentes et radioactives), les hybridations, la détection et la quantification des signaux d'hybridation

Pour les projets basés sur la technologie Affymetrix, la plate-forme prend en charge:

- la préparation des cibles (contrôle qualité des acides nucléiques et marquage)

- la détection et la quantification des signaux d'hybridation

L'analyse et la gestion des résultats s'effectue systématiquement avec les utilisateurs. Plusieurs outils permettant la normalisation des données de puces ainsi que leur analyse statistique sont installés à la plate-forme. Nous utilisons essentiellement l'environnement R (Bioconductor) ainsi que plusieurs logiciels commerciaux (ArrayMiner, S-Plus-ArrayAnalyzer...). En collaboration avec S. Moreira et I. Moszer (plate-forme Intégration et Analyse Génomique) une base de données a été développée selon les normes MIAME. Elle permet le stockage et la gestion des données issues d'expériences de puces sur lames de verre et sur membranes en nylon.

La plate-forme met également à la disposition des utilisateurs du campus plusieurs outils permettant de vérifier la qualité des acides nucléiques (BioAnalyzer Agilent) et des cibles marquées (Nanodrop et Spectrophotomètre pour microplaques). Elle met également à disposition du campus un appareil de RT PCR (Applied Biosystems 7900) permettant la validation des résultats de puces à ADN.

Projets concernant les microorganismes modèles ou pathogènes:

Au cours de l'année 2005, la plate-forme a participé à plusieurs projets d'analyse du transcriptome et de génomique comparée de microorganismes pathogènes. Ils ont été sélectionnés lors des différents appels d'offres; beaucoup de projets puces à ADN durent plus d'un an. Ces projets font appel à la technologie des macroarrays et des microarrays. Chaque projet est pris en charge par un membre de la plate-forme en collaboration avec une personne de l'équipe demandeuse. La liste de tous les projets auxquels nous participons est consultable sur le site web de la plate-forme.

Ces projets concernent notamment les génomes de Bacillus anthracis (coll. M. Mock), Bordetella (coll. N. Guiso), Candida glabrata (coll. B. Dujon), Entamoeba histolytica (coll. N. Guillen), Legionella pneumophila (coll. C. Buchrieser), Plasmodium falciparum (coll. P. David), Staphylococcus aureus (coll. T. Msadek), Streptomyces lividans (coll. P. Mazodier) et Yersinia (coll. E. Carniel).

Les questions biologiques posées au travers de ces projets sont centrées sur les domaines suivants :

- étude des facteurs de virulence

- transcriptome comparé inter-espèces

- étude des interactions hôte-pathogène

- étude des effets sur le pathogène des pressions environnementales (stress, pressions immunes, pressions médicamenteuses…)

- identification des cibles de régulateurs (virulence, mobilité…)

Projets concernant les eucaryotes supérieurs:

La très grande majorité des projets concernant les eucaryotes supérieurs font appel à la technologie Affymétrix. Celle-ci présente la particularité de synthétiser sur un support en verre des oligonucléotides courts par une méthode de photolithographie in situ. Ces puces sont à haute densité (sur les puces de dernière génération, 54 000 jeux de sondes interrogent 47 400 transcrits pour l'ensemble du génome humain). Cette technologie permet des études de transcriptome, de génotypage moléculaire et de détection de polymorphisme humain. Plusieurs projets ont été sélectionnés lors des différents appels à propositions et, comme les projets macroarrays-microarrays, la plupart durent plus d'un an. Chaque projet retenu est financé à hauteur de 2/3 par l'Institut Pasteur et 1/3 par l'Unité demandeuse sur fonds propres. Les questions abordées dans le cadre de ces projets sont centrées essentiellement sur la réponse de l'hôte à l'infection et sur la biologie du développement. Un total de 13 projets ont été financés en 2005. La liste de tous les projets Affymetrix est consultable sur le site web de la plate-forme.

Deux autres projets ne faisant pas appel à cette technologie ont également été pris en charge par la plate-forme. Il s'agit du développement de puces dédiées à l'analyse des profils d'expression des microRNAs chez la drosophile (coll. C. Antoniewski) et de puces génomiques pour la région du centre d'inactivation du chromosome X murin (coll. C. Avner). Pour ces deux projets, des puces sur lames de verre ont été élaborées.

Activités de formation:

La plate-forme participe à des degrés divers à plusieurs cours Pasteur (Génétique Cellulaire et Moléculaire, Microbiologie Générale, Génétique Moléculaire de la souris, Biochimie des protéines). Nous avons également organisé des ateliers de formation permanente dédiés aux puces à ADN (à l'Institut Pasteur et à l'Université Louis Pasteur de Strasbourg). Enfin, la plate-forme a organisé un cours d'une semaine dédié à l'analyse et la gestion des résultats de puces à ADN.

Mots-clés: transcriptome, génomique comparée, maladies infectieuses, macroarrays, microarrays, Affymetrix


Rapports d'activité 2005 - Institut Pasteur
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