Unité: Pathogénie Microbienne Moléculaire

Responsable: Philippe SANSONETTI

Notre unité étudie les bases moléculaires de la rupture, de l'invasion et de la destruction inflammatoire de la barrière intestinale par les bactéries invasives et les mécanismes de défense et de protection contre ces infections. Notre modèle est Shigella, l'agent responsable de la dysenterie bacillaire. Nous appliquons une combinaison de génétique moléculaire, génomique fonctionnelle, biologie cellulaire, médecine expérimentale et immunologie. Nous identifions les gènes microbiens, la régulation de leur expression et leurs produits modifiant le comportement des cellules épithéliales ou phagocytaires de l'hôte. La signalisation conduit à l'internalisation du microorganisme, son mouvement intracellulaire et sa dissémination dans l'épithélium. La présence du microorganisme au sein de la cellule épithéliale et son interaction avec les cellules phagocytaires induisent une cascade de signalisations pro-inflammatoires causant une rupture de la barrière épithéliale intestinale et son éventuelle destruction. Nous développons des approches innovantes d'imagerie cellulaire et tissulaire et d'analyse transcriptomique afin de détecter, analyser et suivre infection et inflammation. L'influence de cette réponse immunitaire innée sur la réponse immunitaire spécifique, ainsi que les mécanismes inducteurs et effecteurs de cette réponse spécifique sont aussi étudiés. Ces études fondamentales sont appliquées au développement de candidats vaccins contre la dysenterie bacillaire. Des essais cliniques de phase 1 et 2 sont actuellement en cours.

Génétique du phénotype invasif de Shigella flexneri

Chercheur statutaire : Claude Parsot. Chercheur post-doctorant : John Rohde. Doctorant: Christophe Penno. Technicienne : Elisabeth Ageron.

Les déterminants de l'entrée et de la dissémination des bactéries dans les cellules épithéliales sont codés par un plasmide de 213 kb, pWR100. Ce plasmide contient une région de 30 kb qui spécifie un appareil de sécrétion de type III (l'appareil Mxi-Spa), des protéines sécrétées par cet appareil (les protéines IpaA-D, IpgB et IpgD) et des chaperons cytoplasmiques (IpgC, chaperon de IpaB et IpaC ; IpgE, chaperon de IpgD ; Spa15, chaperon de IpaA, IpgB et OspC3). L'appareil de sécrétion est activé lors du contact de la bactérie avec des cellules eucaryotes, ce qui induit la sécrétion des protéines IpaA-D et IpgB et IpgD. Le plasmide spécifie également une vingtaine d'autres protéines sécrétées par l'appareil Mxi-Spa (les protéines Osp et IpaH), certaines de ces protéines n'étant produites qu'en conditions de sécrétion.

Les travaux effectués portent sur trois aspects principaux : 1) Le rôle des protéines Osp et IpaH dans le pouvoir pathogène de S. flexneri, abordé en utilisant une approche génétique consistant à inactiver systématiquement les gènes correspondants et à caractériser le phénotype des mutants in vitro et in vivo. 2) Les interactions entre protéines sécrétées et chaperons, analysées en utilisant la technique du double hybride dans la levure, des méthodes de copurification dans S. flexneri et une analyse structurale cristallographique. Nous avons ainsi identifié les sites d'interaction de IpgC sur IpaB et IpaC. L'analyse structurale de ces chaperons est en cours. 3) Le mécanisme du contrôle de la transcription des gènes osp et ipaH par l'activité de sécrétion a été élucidé et met en oeuvre un activateur de transcription de la famille AraC, MxiE, dont l'activité dépend du chaperon IpgC et de l'existence d'une séquence opératrice consensus en amont de ces gènes. Ce régulon apparait jouer un rôle essentiel dans le contrôle par Shigella de la réponse innée, en particulier inflammatoire induite au niveau de la muqueuse. La protéine OspG, par exemple, lie certains membres de la famille des enzymes de conjugaison de l'ubiquitine et inhibe de ce fait ubiquitination et dégradation de I-kB, conférant ainsi une propriété anti-inflammatoire à la bactérie.

Figure 1 = Le plasmide de virulence pWR100 de 214 kb de Shigella flexneri.

Molécules et signaux impliqués dans l'entrée de Shigella dans les cellules épithéliales et dans le passage de cellule à cellule.

Chercheur statutaire : Guy Tran Van Nhieu. Chercheurs post-doctorants : Gianfranco Grompone, Jost Enninga. Doctorants : Laurence Bougnères, Valentin Jaumouillé. Ingénieure: Joëlle Mounier.

Nous étudions la cascade de signalisation qui cause les remaniements du cytosquelette cellulaire responsables de la formation du foyer de macropinocytose qui amène l'internalisation de Shigella dans les cellules épithéliales. Nous analysons plus particulièrement le rôle des petites GTPases de la famille Rho, Cdc42 et Rac et l'activation de la tyrosine kinase p60c-src. Ces deux voies de signalisation sont engagées simultanément durant l'entrée de Shigella dans la cellule, la protéine IpaC qui s'insère dans la membrane de la cellule épithéliale infectée, participe directement à l'activation de ces voies. Cdc42 et Rac sont responsables de la polymérisation de l'actine et de la formation des filopodes et lamellipodes qui entourent le corps bactérien, induisant son internalisation par la cellule. La polymérisation de l'actine en aval de ces GTPases, à distance du site d'interaction entre le corps bactérien et la membrane cellulaire, fait intervenir la tyrosine phosphorylation de la cortactine par p60c-Src, son recrutement à la membrane via l'adaptateur Crk et l'activation du complexe Arp2/3. La protéine IpaA assure la pénétration finale de la bactérie et la " réparation " du foyer d'entrée en s'associant à la vinculine en coiffe l'extrémité barbée des filaments d'actine, et induit leur dépolymérisation.

Nous avons par ailleurs démontré le rôle important de connexines dans l‘invasion et le passage de cellule à cellule de Shigella. L'ouverture des hémi-canaux des cellules infectées entraine la libération d'ATP qui, par un effet paracrine, entraine la survenue de flux calciques itératifs au sein des cellules adjacentes non infectées. Ce mécanisme original de signalisation accroit considérablement le niveau de permissivité de ces cellules à l'infection par Shigella, qu'il s'agisse au niveau de l'entrée ou du passage de cellule à cellule.

L'ATP joue un rôle essentiel dans les étapes ultra précoces de formation du foyer d'entrée via la formation d'extensions cellulaires, ou nanopodes, qui capturent les bactéries.

Figure 2 = Recrutement de la tyrosine kinase Src au site d'invasion de Shigella dans les cellules HeLa. rouge : actine, bleu : bactérie, vert, Src-GFP

Bases moléculaires et cellulaires de la rupture, de l'invasion et de la destruction inflammatoire de la barrière épithéliale intestinale par Shigella

Chercheurs statutaires : Philippe Sansonetti, Laurence Arbibe, Régis Tournebize, Stephen Girardin. Chercheur post-doctorant : Irit Paz. Doctorants : Jean Bergounioux, Meng-Tsung Tien. Ingénieur : Thierry Pédron.

Dans le cadre de notre projet visant à comprendre comment Shigella assure l'invasion et la destruction inflammatoire de la barrière intestinale, nous avons démontré le rôle essentiel joué par la protéine cytosolique Nod1 qui reconnaît le peptidoglycane des bactéries à gram négatif et induit l'activation de la voie NF-κB et JNK, initiant ainsi une puissante réponse inflammatoire, dominée par la production d'IL-8.

Cette réaction inflammatoire est efficacement régulée négativement par certaines protéines, comme OspG et OspF qui induisent un profil de réponse inflammatoire adapté à l'équilibre du processus infectieux. Nous avons par ailleurs démontré que c'est largement l'absence d'expression d'IL-8 par la souris qui explique son incapacité à déclencher une inflammation intestinale aigüe en présence de Shigella.

Sous la pression sélective de l'immunité innée, les bactéries ont développé un mécanisme de réduction de longueur des chaines latérales du LPS en induisant une contrainte hélicoidale par glycosylation sur le motif de base Rha-Rha-Rha-NacGlu. Ceci permet l'émergence en surface et une activité optimale de l'appareil de sécrétion de type III tout en préservant la résistance à la réponse innée. Nous avons aussi démontré le rôle anti-inflammatoire joué par des bactéries commensales - probiototiques - comme Lactobacillus casei en présence d'une infection par Shigella.

Nous développons par ailleurs des méthodes d'analyse en temps réel des processus infectieux basées sur l'IRM ainsi que des modèles murins, y compris transgéniques, d'inflammation de l'intestin et des voies respiratoires. Ces approches nous ont permis d'introduire une nouvelle thématique visant à étudier les mécanismes moléculaires cellulaires et tissulaires d'infection du tissu trachéobronchique et pulmonaire par Klebsiella pneumoniae.

Photo 3: Reconstruction 3D de poumons de souris.

Immunité intestinale spécifique au cours de la dysenterie bacillaire.

Chercheur statutaire : Armelle Phalipon. Chercheur post-doctorant: Gernot Sellge. Doctorant : Joao Gamelas-Magalhaes. Technicienne : Myriam Tanguy.

Nous étudions de plus en plus précisément la mise en place et la régulation de l'immunité protectrice au cours de la primo-infection et lors d'une ré-infection ainsi que l'influence de la réponse innée sur la mise en place de l'immunité spécifique. Aux étapes très précoces de l'infection, Shigella module la production d'INF-γ. Ceci nous amène à étudier le rôle de la modulation de la réponse innée dans la mise en place de l'immunité humorale protectrice et l'inhibition d'une réponse cellulaire Th1 efficace. Il est probable que les protéines Osp et IpaH jouent un rôle essentiel.

La réponse humorale dirigée contre la partie polyosidique du LPS (Ag-O) est essentielle dans la protection contre une ré-infection. La réponse médiée par des anticorps de type IgG spécifiques de l'Ag-O peut contribuer à la protection si cette réponse est initiée au niveau local, assurant ainsi la présence des effecteurs au site d'infection. Concernant les IgA sécrétoires (S-IgA) requises pour la protection de la muqueuse, nous avons montré, en collaboration avec Blaise Corthésy, que le composant sécrétoire est directement impliqué dans cette fonction de protection en assurant via ses résidus glycosylés une localisation tissulaire appropriée de l'IgA pour une fonction d'exclusion immune optimale. Par ailleurs, nous avons montré que le LPS bactérien absorbé par le pôle apical des cellules épithéliales activait NF-κ B selon une cinétique plus lente que la bactérie invasive. Cette activation est neutralisée par une IgA monoclonale anti-LPS, qui au cours de sa transcytose, intercepte le produit bactérien. Ceci démontre un rôle anti-inflammatoire potentiel original pour les S-IgA. Ainsi, la protection médiée par les IgA sécrétoires anti-LPS semble s'effectuer par un double mécanisme : exclusion immune des bactéries en surface de l'épithélium et neutralisation intracellulaire d'un produit bactérien pro-inflammatoire.

Vers un vaccin vivant oral atténué contre la shigellose.

Chercheurs statutaires : Armelle Phalipon, Philippe Sansonetti.

Avec le soutien de la DGA et en collaboration avec le Centre de Recherche Biomédicale et Vaccinologique, nous avons réalisé une étude de phase I et poursuivons actuellement une étude de phase II de SC599, une souche candidate vaccinale atténuée de S. dysenteriae 1. Notre objectif est d'arriver à un vaccin pentavalent comportant 3 sérotypes de S. flexneri, S. dysenteriae1 et S. sonnei. En parallèle, nous développons une approche de vaccin " sous-unité " basé sur la synthèse chimique des antigènes polyosidiques. Les premiers résultats d'immunogénicité chez la souris sont extrêmement encourageants.

Légendes des photos :

Photo 1: Le plasmide de virulence pWR100 de 214 kb de Shigella flexneri.

Photo 2 : Recrutement de la tyrosine kinase Src au site d'invasion de Shigella dans les cellules HeLa. rouge : actine, bleu : bactérie, vert, Src-GFP.

Photo 3 : Reconstruction 3D de poumons de souris.

Mots-clés: Shigella, épithelium intestinal, invasion, inflammation, réponse immunitaire, vaccin


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