Unité: Organisation nucléaire et oncogenèse - INSERM U.579

Responsable: Anne DEJEAN

Les travaux de l'Unité portent sur l'étude des mécanismes moléculaires et cellulaires à l'origine des cancers chez l'homme avec un accent particulier sur le rôle joué par certaines modifications post-traductionnelles dans les processus tumoraux. Outre leur intérêt sur le plan médical, ces travaux constituent une voie d'approche privilégiée pour une meilleure compréhension de la biologie de la cellule ‘normale'. Deux approches, à la fois distinctes et complémentaires, sont développées. D'une part une approche globale, dite ‘à grande échelle', visant à établir un profil général des altérations génétiques, épigénétiques et post-transcriptionnelles de l'hépatocarcinome (HCC). D'autre part une approche plus ‘fonctionnelle' ayant pour objectif l'étude du rôle la voie SUMO dans le développement et l'oncogénèse.

Génétique et épigénétique du cancer du foie (responsable : Pascal Pineau)

L'un de nos objectifs principaux vise à établir les bases génétiques et épigénétiques du cancer du foie. Pour obtenir une vision globale des altérations chromosomiques qui se produisent dans l'hépatocarcinome (HCC), nous avons fait appel dans le passé à deux approches complémentaires: l'allélotypage et l'hybridation génomique comparative. Ces deux approches nous ont permis de mettre en évidence les principales cibles de délétions du cancer du foie susceptibles de comporter des activités oncosuppressives. Parmi les régions subissant des pertes significatives, se trouvent les bras chromosomiques 8p et 4q où aucun gène suppresseur de tumeur n'a été mis en évidence à ce jour. Afin d'identifier de nouvelles voies de signalisation altérées dans l'HCC, nous avons entrepris la recherche de délétions homozygotes (DH) dans des lignées tumorales en culture. En effet, la recherche de DH s'est révélé être un outil majeur d'identification des suppresseurs de tumeur au cours des dernières années. Nous avons ainsi constitué au laboratoire une large collection de 166 lignées cellulaires d'origine tumorale dont 60 lignées dérivées de cancer du foie. L'ensemble de ces lignées ont été étudiées sur 250 loci du génome humain. Les loci choisis correspondaient essentiellement à des gènes suppresseurs de tumeurs avérés ou potentiels. Au total, plus d'une centaine de DH affectant 24 loci différents furent identifiées. Parmi les gènes subissant des délétions homozygotes, INK4A et p53 étaient attendus. Cependant, six autres candidats suppresseurs de tumeur affectés par des DH n'avaient jamais été impliqués dans le cancer du foie. Il s'agit entre-autres de PTEN, BAX, STK11 ou NF2. Ceux-ci sont des suppresseurs de tumeurs avérés impliqués dans des fonctions aussi diverses que le contrôle de la transmission du stress oncogénique envoyé par les kinases AKT ou PI3K (PTEN), la mort cellulaire programmée (BAX, STK11) ou le contrôle de la croissance cellulaire dépendant des interactions membrane-cytosquelette (NF2). Cette approche nous a également permis de mettre en évidence des mutations jusqu'alors inconnues dans divers autres types de tumeurs (poumon, ovaire, cancer épidermoides ORL..). Pour valider cette méthodologie, nous avons prolongé les investigations par une analyse mutationnelle de quatre de ces gènes dans 32 HCC sélectionnés sur la base d'une délétion d'un des deux allèles. Des mutations de PTEN furent trouvées dans 21% (5/24) des specimens européens contre 0 % (0/8) chez les patients asiatiques indiquant que la recherche de délétions homozygotes est une approche efficace pour l'identification de nouveaux candidats suppresseurs de tumeurs.

Une étude de transcriptome sur le cancer du foie a par ailleurs été initiée afin de définir les principaux profils d'expression de cette tumeur très hétérogène. Ces travaux devraient à terme permettre d'établir une classification à valeur prédictive et thérapeutique du carcinome hépatocellulaire. Un nouvel axe vise à étudier les profils généraux et spécifiques de modification de la chromatine tant au niveau des histones que de l'ADN. Ces analyses seront complétées par l'étude du potentiel anti-tumoral des HDACi in vitro ainsi que dans des modèles murins de carcinogénèse hépatique. Nous menons parallèlement une étude exhaustive de l'expression des principaux acteurs des voies de régulation épigénétique (enzymes de modification/démodification, modificateurs eux-mêmes, variants d'histones…) dans l'HCC. Finalement, nous cherchons à évaluer le rôle joué par les miRNAs dans le développement de l'HCC à la fois par une approche globale de type ‘microtranscriptome' ainsi que par une approche plus mécanistique portant sur certains miRNAs candidats.

Compartimentalisation fontionnelle du noyau et modification par SUMO (responsables : Jacob Seeler, Oliver Bischof)

L'un des aspects majeurs de la pathogénèse des leucémies aigües promyélocaytaires implique, d'une part, la présence de l'oncoprotéine hybride PML-RARα et, d'autre part, la désagrégation réversible par l'acide rétinoïque des corps nucléaires PML. Cette dernière observation, qui fournit un parallèle frappant à l'effet thérapeutique des rétinoïdes dans ce type d'hémopathies, permet ainsi d'impliquer un nouvel ‘organelle' nucléaire dans une pathologie humaine. Etudiant les signaux susceptibles de réguler la dynamique des corps nucléaires, nous avons identifié un nouveau type de modification post-traductionnelle apparentée à l'ubiquitination, la voie SUMO qui semble jouer un rôle majeur dans la formation de ces structures. Cette modification, contrairement à l'ubiquitination, n'est pas associée à une dégradation de ses protéines cicles mais semble jouer un rôle majeur dans leur compartimentalisation subcellulaire. Notre laboratoire ainsi que d'autres ont identifié un certain nombre de substrats pour SUMO, plusieurs d'entre eux étant associés aux corps nucléaires (voir Figure) . La voie enzymatique de sumoylation implique une enyzyme d'activation E1 (hétérodimère Uba2/Aos1), une enzyme de conjugaison E2 (Ubc9) et trois familles de E3 ligases (RanBP2, PIAS et Pc2) qui sont censées conférer la spécificité de reconnaissance des substrats. La démodification est assurée par des hydrolases (SENPs) qui sont au nombre de 7 chez l'homme. Compte-tenu du lien étroit existant entre la sumoylation et la dynamique des corps nucléaires, nous consacrons un effort important à l'étude de cette voie de modification post-traductionnelle afin de clarifier son rôle dans l'organisation générale du noyau de la cellule normale et de la cellule leucémique. Par ailleurs nous poursuivons parallèlement l'étude de la protéine PML et cherchons notamment à caractériser son rôle dans les processus de sénescence cellulaire.

Afin de préciser les mécanismes impliqués dans la sénescence induite par PML, nous avons utilisé les oncoprotéines E6 et E7, lesquelles ciblent respectivement les voies p53 et Rb, et avons montré que ces deux voies sont activées et nécessaires. De plus l'oncoprotéine E7 est capable d'inhiber ce processus en s'associant physiquement avec PML. Ainsi PML constituerait, à coté de Rb, une nouvelle cible cellulaire pour E7. Dans le but d'identifier de nouveaux médiateurs impliqués dans la sénescence médiée par PML, une collaboration a été établie avec le laboratoire de R. Bernards (NKI, Amsterdam) destinée à caractériser de nouveaux gènes dont l'extinction conduirait à contourner ce processus. Parallèlement, nous avons montré que la SUMO E3 ligase PIASy est un inducteur efficace de la sénescence cellulaire suggérant que PIASy puisse être impliquée dans la même voie de sénescence que PML. En conséquence, nous avons utilisé la même stratégie (‘senescence-bypass shRNA screen') afin d'identifier les acteurs du processus de sénescence cellulaire induite par PML et PIASy. Ces deux approches complémentaires devraient permettre de mieux comprendre le rôle de PML et de la sumoylation dans la sénescence médiée par les oncogènes et pourrait conduire à définir de nouvelles stratégies anttumoales basées sur la réactivation d'un programme de sénescence efficace.

Afin de clarifier le rôle général de la voie SUMO chez les mammifères, nous avons réalisé un knock out constitutif du gène Ubc9 codant pour l'unique enzyme E2. L'inactivation de cette voie conduit à une létalité embryonnaire très précoce ainsi qu'à des défauts majeurs de ségrégation des chromosomes et des désordres sévères dans l'organisation nucléaire incluant une dysmorphie de l'enveloppe nucléaire et une désagrégation des nucléoles et des corps nucléaires PML. De plus, le gradient de Ran est totalement perturbé. Ces observations révèlent un rôle majeur d'Ubc9 et par conséquent de la sumoylation, dans l'architecture et la fonction du noyau, dans la structure et la ségrégation des chromosomes ainsi que dans la viabilité chez les mammifères. En collaboration avec l'équipe de B. Arcangioli (Institut Pasteur), nous avons montré que, chez la levure S. pombe, la protéine Pli1p fonctionne comme une SUMO E3 ligase. Les cellules délétées pour Pli1p présentent une perte des minichromosomes, une sensibilité accrue pour la drogue TBZ ainsi qu'un allongement de la taille des télomères. Ces données suggèrent que Pli1p, et par extension , la voie SUMO, jouerait un rôle dans la protection des séquences répétées hétérochromatiques (ie : centromères et télomères) de la recombinaison illégitime. Nous chercherons à identifier les substrats impliqués dans ce processus ainsi que les mécanismes par lesquels la sumoylation régule leur activité.

Figure: Corps Nucléaires PML et Modifications par SUMO

Mots-clés: oncogénèse, corps nucléaires PML, SUMO, sénescence cellulaire, chromatine, épigénétique, leucémies, cancer du foie


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