Unité: Membranes Bactériennes

Responsable: Cécile Wandersman

L'unité des membranes bactériennes étudie les transports membranaires chez les bactéries à Gram négatif en développant plusieurs thématiques de recherche: l'acquisition de l'hème, la sécrétion de protéines dépourvues de peptide signal par les transporteurs ABC, la caractérisation de protéines ABC de fonction inconnue, un système à deux composants impliqué dans l'acquisition du fer. Depuis peu, nous commençons l'étude du transport de l'hème chez Bartonella birtlesii.

1) Systèmes d'acquisition de l'hème (Sylvie Létoffé, Laurent Debarbieux, Philippe Delepelaire, Francis Biville, Frédéric Huché, Helène Cwerman, Najla Benevides Matos)

Chez les bactéries à Gram négatif, les systèmes d'acquisition de l'hème source majeure de fer font intervenir des récepteurs de la membrane externe bien conservés. Ils appartiennent à une famille de protéines impliquées dans le transport actif de divers substrats tels que les sidérophores et la vitamine B12. Plusieurs récepteurs déjà cristallisés présentent une structure conservée avec un tonneau de feuillets bêta fermé par un domaine N-terminal périplasmique. Celui-ci interagit avec la protéine TonB énergisant du transport. Les récepteurs à hème sont plus ou moins spécifiques pour l'hème ou les hémoprotéines exogènes, ou pour des hémophores qui sont de petites protéines affines pour l'hème, sécrétées par la bactérie (Fig. 1).

Les études structurales et génétiques de l'hémophore HasA de Serratia marcescens nous ont permis d'identifier les résidus ligands de l'hème, de préciser leur rôle respectif, de comparer les structures de l'holo et de l'apo-hémophore, de mesurer les affinités de l'apo et holo-hémophore pour le récepteur HasR et d'identifier leurs sites d'interaction avec le récepteur. HasA interagit avec HasR par deux domaines de liaison indépendants, chacun situé sur un feuillet bêta de la protéine. La fixation de l'hémophore par ses deux sites de liaison déformerait la protéine de telle façon qu'elle transfère son hème au récepteur (Fig. 2).

Le récepteur HasR fixe aussi l'hème libre par deux résidus histidines conservés sur les récepteurs à hème. Mais l'affinité pour l'hème est bien plus faible que celle de HasA. Ainsi, au cours du processus d'acquisition de l'hème, il se produit un transfert de l'hème d'une protéine de très haute affinité (HasA) à une protéine d'affinité plus faible (HasR). Nos études biochimiques montrent que le transfert d'hème de l'hémophore au récepteur se produit in vitro sans apport d'énergie.

Après transfert de l'hème à HasR, l'apo-hémophore reste lié au récepteur. Son éjection est un processus actif dépendant de TonB.

Certains récepteurs de la membrane externe, dont HasR, sont induits par la fixation du ligand sur leurs récepteurs; ce qui module l'activité de facteurs sigma et anti-sigma spécifiques. Dans le cas de HasR, le seul ligand inducteur est l'holo-hémophore. A l'aide d'une collection de mutants de HasA et de HasR, nous avons disséqué le stimulus inducteur en 2 composants : l'hème et le pentapeptide 51-55 de l'hémophore (qui correspond à une partie d'un des deux domaines de liaison de HasA à son récepteur) (Manuscrit Cwerman et al. en révision à J. of Bacteriol.). Nos expériences suggèrent que les mécanismes d'induction et d'acquisition de l'hème sont différents. Alors que l'acquisition de l'hème requiert le recyclage des hémophores vides, l'induction pourrait se produire sans ce recyclage, hypothèse que nous testons actuellement.

Le facteur anti-sigma HasS est soumis à la même cascade d'induction que HasR. C'est le seul anti-sigma bactérien connu soumis à cette régulation supplémentaire.

La protéine HasR a été soumise à un découpage moléculaire en domaines et à une mutagenèse dirigée en utilisant la modélisation par homologie du récepteur HasR. Ce travail a d'une part montré que le tonneau β exprimé seul forme un pore de diffusion spécifique pour l'hème et a permis de définir des boucles externes du tonneau β qui interagiraient avec l'hémophore (Fig. 3).

Chez S. marcescens il y a 2 gènes homologues hasB et tonB qui ont des fonctions redondantes seulement pour l'acquisition de l'hème via HasR. Chez E. coli la protéine mutante HasB6 fonctionnelle peut remplacer TonB mais uniquement pour l'acquisition de l'hème en présence de HasR. Nous avons voulu déterminer si HasB était spécifique de l'hème ou du récepteur HasR. Pour cela, nous avons cloné le gène hemR de S. marcescens DB11 (souche de référence séquencée) chez E.coli. Il y est fonctionnel et permet l'acquisition de l'hème. Néanmoins le transport de l'hème via HemR est activé par TonB mais pas par HasB6. Ceci suggère que HasB est spécifique du récepteur HasR et pas de l'hème.

L'inactivation des gènes tonB, HasA, hasR, et hemR dans la souche DB11 est en cours afin de tester leur virulence dans le modèle Caenorhabditis elegans développé par le groupe de Jonathan Ewbank. Un travail récent a montré que C. elegans et plus généralement les helminthes sont auxotrophes pour l'hème et l'utilisent aussi comme source de fer. Il est donc possible que la restriction en hème et en fer provoquée par S. marcescens contribue à la vermicidie.

2) Transport de l'hème chez Bartonella birtlesii. (Francis Biville en collaboration avec le groupe Henri-Jean Boulouis (INRA)

Les bactéries du genre Bartonella sont des bactéries intracellulaires facultatives à tropisme intra-érythrocytaire et à transmission vectorielle. Le nombre de nouvelles espèces découvertes est en constante évolution et à ce jour on en dénombre 18 dont certaines sont des agents pathogènes pour l'homme et l'animal. Le parasitisme intra-érythrocytaire, commun à toutes les espèces de Bartonella, est un aspect essentiel de leur biologie. Les modèles in vivo d'infection expérimentale montrent que Bartonella colonise une niche primaire encore inconnue avant d'envahir le sang où la bactérie pénètre et se multiplie dans les globules rouges. Par comparaison de séquences, nous avons ainsi amplifié et cloné 3 gènes de Bartonella birtlesii codant pour des protéines de la membrane externe capable de fixer l'hème. Leurs fonctions dans l'acquisition de l'hème restent à définir.

3) La sécrétion des protéines par les transporters ABC (Sandra Cescau, Laurent Debarbieux, Annick Paquelin et Philippe Delepelaire)

La voie ABC (pour ATP Binding Cassette) ou voie de type I permet la sécrétion de protéines dépourvues de peptide signal N-terminal et indépendamment du mécanisme universel de translocation des polypeptides.

Cette voie est caractérisée par la présence, dans le transporteur, d'une ATPase membranaire appelée protéine ABC. Ces protéines sont impliquées dans de très nombreux transports membranaires dont certains sont essentiels à la vie cellulaire.

Notre équipe a montré que cette voie permet la sécrétion de protéines de fonction et d'origine très diverses ayant toutes un signal C-terminal. C'est en particulier le cas des hémophores (HasA). Puis nous avons établi que les transporteurs comprennent outre la protéine ABC, deux autres protéines de l'enveloppe bactérienne dont une protéine de la membrane externe appartenant à la famille TolC, une protéine multifonctionnelle nécessaire à l'efflux des drogues et des sels biliaires (Fig. 1).

Le signal de sécrétion C-terminal reste exposé sur la protéine grâce à des chaperons cytoplasmiques nécessaires à la sécrétion. Nos études sur la sécrétion de l'hémophore HasA ont établi que ce signal reconnaît la protéine ABC, module l'hydrolyse de l'ATP et induit la formation d'un complexe multiprotéique. La protéine HasA délétée de son signal C-terminal interagit encore avec la protéine ABC et cette interaction permet la formation d'un complexe multi-protéique stable piégeant la protéine TolC qui ne serait plus disponible pour participer à l'efflux des drogues et sels biliaires. Ceci nous donne un crible pour localiser ce deuxième site d'interaction avec la protéine ABC et définir le rôle de l'ATP dans la formation et la dissociation du complexe.

Nos futures recherches s'orientent aussi vers la localisation sur HasA du site d'interaction avec le chaperon SecB.

Le complexe pluriprotéique associant les protéines du transporteur et un substrat bloqué dans le transporteur a été purifié et est en cours d'analyse en microscopie. Nous avons également entrepris la réassociation du complexe à partir de ses composants purifiés; les purifications ont été mises au point sur la protéine ABC, le complexe protéine ABC-protéine MFP et la protéine de membrane externe et les premières indications de réassociation ont été obtenues. La protéine ABC, qui interagit avec l'ATP, le signal de sécrétion et la protéine MFP est mutagénisée par insertion de pentapeptide pour obtenir des indications sur ses sites d'interaction potentiels. Les interactions seront aussi mesurées par ITC et Biacore.

4) Analyse fonctionnelle et phylogénétique des systèmes ABC (Elie Dassa, Dorothée Murat)

La fonction des protéines ABC dépourvues de domaines transmembranaires est mal connue chez les procaryotes. La délétion du gène codant pour Uup entraîne une augmentation de la fréquence d'excision des transposons. Pour comprendre le mécanisme moléculaire de l'action de Uup, nous avons purifié la protéine et montré qu'Uup est une ATPase cytoplasmique capable d'hydrolyser l'ATP in vitro. L'ATP provoque un changement conformationnel important qui met en jeu un domaine C-terminal présentant de fortes similitudes avec le domaine "Little Finger" (LF) des ADN-polymérases translésionnelles, Dans ces enzymes, ce domaine lie l'ADN et assure la processivité de la réplication. Nous avons montré que Uup est capable de se lier à l'ADN, et que son domaine LF est en partie responsable de cette interaction. L'analyse de mutants affectés dans l'hydrolyse de l'ATP montre que l'hydrolyse de l'ATP est requise pour la fonction d'Uup in vivo. Uup est une nouvelle protéine capable de se lier à l'ADN. Nos résultats suggèrent qu'en interagissant avec l'ADN, Uup pourrait empêcher la survenue de recombinaisons illégitimes dont l'exemple le plus frappant est l'excision précise des transposons (D. Murat et all, JBC sous presse).

Figure 1: Voie d'acquisition de l'hème dépendant d'un hémophore

Figure 2 Comparaison des structures de apo et holo-HasA

Figure 3 : Modélisation de HasR avec les 2 histidines conservées (H189 et H603)

Mots-clés: Transport membranaire, acquisition du fer, hémophore, protéine ABC


Rapports d'activité 2005 - Institut Pasteur
filet

Debut de Page recherche Portail Institut Pasteur

En cas de problèmes, de remarques, ou de questions concernant cette page Web écrire à rescom@pasteur.fr