Unité: Génétique Moléculaire Bactérienne

Responsable: Stewart COLE

Afin de poursuivre notre avancée dans la connaissance de la tuberculose et de la lèpre, une approche de génomique comparative et fonctionnelle a été entreprise sur leurs agents étiologiques respectifs, Mycobacterium tuberculosis et M. leprae. De nouvelles cibles pour la mise au point de médicaments et de nouveaux candidats vaccins sous-unitaires ont été identifiés et sont actuellement en cours de caractérisation. Cette approche a été étendue à un pathogène émergent à l'origine de l'ulcère de Buruli, M. ulcerans.

La recherche de nouvelles cibles permettant l'élaboration d'inhibiteurs puissants capables de contrôler l'initiation et/ou l'établissement des clostridies pathogènes dans les différents sites infectieux, est l'axe principal des recherches que nous menons sur ces bactéries anaérobies. Dans cette perspective, nous avons entrepris d'étudier les mécanismes de régulation et de transport des toxines, principaux facteurs de virulence de ces organismes et de caractériser le pouvoir antigénique de certaines protéines membranaires de type PspA.

Génomique fonctionnelle du complexe Mycobacterium tuberculosis : Sécrétion et facteurs de virulence (Priscille Brodin, Marien de Jonge, Caroline Demangel, Brigitte Saint-Joanis, Roland Brosch, Stewart Cole)

Mycobacterium tuberculosis, l'agent de la tuberculose humaine, partage plus de 99,9 % d'identité de son ADN chromosomal avec les autres membres du complexe du bacille tuberculeux, M. bovis, M. microti, M. africanum, M. canettii et M. tuberculosis. Une étude de la présence ou de l'absence des régions de différence chez un grand nombre de souches du complexe M. tuberculosis a permis de définir des relations phylogénétiques entre les différents membres du complexe et de proposer un nouveau schéma de l'évolution des bacilles tuberculeux, remettant en question l'hypothèse actuelle selon laquelle M. bovis serait l'ancêtre de M. tuberculosis. Cette étude a également démontré que certaines de ces régions de différence (TbD1, RD9, RD4) sont des marqueurs puissants pour l'identification rapide des bacilles tuberculeux.

La région RD1 est particulièrement intéressante pour nous aider à mieux comprendre les mécanismes moléculaires de la pathogenèse du bacille tuberculeux, car elle est la seule région absente des souches atténuées M. bovis BCG et M. microti, et présente chez tous les autres membres du complexe. Cette région RD1 code pour deux antigènes immunodominants de la famille d'ESAT-6. Nous avons montré que la complémentation du BCG par RD1 (BCG::RD1) s'accompagne d'un changement de morphologie des colonies, qui les rapproche des souches virulentes. Chez les souris immunodéficientes et immunocompétentes, BCG::RD1 se dissémine de façon plus significative que le BCG. Toutefois, BCG::RD1 reste beaucoup moins virulent que M. tuberculosis, et sa persistance est bien contrôlée par les organismes hôtes immunocompétents par l'induction de réponses immunitaires cellulaires spécifiques de type Th1. Afin de caractériser plus amplement les antigènes présents dans cette région, nous avons étudié la capacité des protéines PE35, PPE68, Rv3878 et Rv3879c à générer une réponse immunitaire cellulaire chez la souris. Seule la protéine PPE68 est capable d'induire une réponse de type Th1 et l'épitope T identifié correspond à celui reconnu par les patients tuberculeux.

Dans une perspective vaccinale, l'immunisation par le vaccin recombinant BCG::RD1 confère un meilleur niveau de protection contre la tuberculose extrapulmonaire et sa pathologie par rapport à l'immunisation par le BCG seul. Des résultats similaires ont été obtenus suite à l'immunisation par M. microti::RD1 dont la virulence et la persistance sont moins importantes que le BCG::RD1. La mise au point de BCG::RD1 et M. microti::RD1 représente donc une avancée importante dans la conception de vaccins anti-tuberculeux plus efficaces, dont nous poursuivons actuellement l'optimisation.

En parallèle, cette étude a conduit à la mise en évidence de l'existence d'une machinerie de sécrétion spécifique nécessaire à l'exportation appropriée d'ESAT-6 et de CFP-10 au système immunitaire. Une approche basée sur des mutants génétiques a permis de montrer que certaines protéines de la région RD1 en amont et en aval d'ESAT-6 sont requises pour sa sécrétion hors de la mycobactérie et nous apportons au laboratoire une attention toute particulière à la caractérisation de ce système d'exportation.

Nous étudions également chez Mycobacterium tuberculosis le système de sécrétion TAT (Twin Arginine Translocation). Ce système annexe de sécrétion assure l'exportation de protéines repliées, comportant un motif spécifique avec deux arginines contiguës au niveau de leur peptide-signal. Nous avons démontré que le système TAT est essentiel à la survie bactérienne, et que d'autre part un de ces substrats intervient dans le métabolisme lipidique. Ce jeu de résultats dévoile un aspect métabolique essentiel du bacille tuberculeux.

Analyse post-génomique de Mycobacterium leprae (Nadine Honoré, Marc Monot)

Les études génomiques réalisées à partir de différents isolats de Mycobacterium leprae montrent l'extrordinaire stabilité génomique de ce pathogène responsable de la lèpre. L'évolution réductive précédemment décrite aurait ainsi eu lieu avant sa propagation mondiale. La découverte de rares mutations ponctuelles (S.N.P) et l'étude de leur polymorphisme nous ont permis de retracer la dissémination de la lèpre à travers le monde. L'origine humaine de cette maladie se trouverait soit en Afrique de l'Est soit au Proche Orient, et elle se serait répandue grâce aux grandes migrations de populations.

Le deuxième aspect de nos recherches concernant la lèpre est la mise au point d'un test immunodiagnostic sensible et fiable qui permette de détecter tous les patients infectés. En effet, le contrôle de cette maladie ne sera possible que par une identification rapide de tous les cas infectieux. Grâce à la génomique comparative et l'analyse informatique nous avons sélectionné et produit 17 protéines candidates dont l'antigénicité a été testée chez l'homme dans différents pays endémiques : la Corée, le Mali et le Bangladesh. Les premiers résultats sont très encourageants.

Le séquençage du génome de Mycobacterium bovis et de M. bovis BCG Pasteur (Thierry Garnier, Wafa Frigui, Stewart Cole)

La finition de la séquence de Mycobacterium bovis ainsi que son annotation avaient été réalisées en 2003. Brièvement, le génome de M. bovis comprend 4345492 paires de bases et code pour 3952 protéines. L'obtention de cette séquence nous a permis des comparaisons tant au niveau nucléotidique (" Single Nucleotide Polymorphism ") qu'au niveau génétique avec le génome de M. tuberculosis.

Le séquençage du génome de M. bovis BCG Pasteur a été réalisé. Composé de 4375192 bases, son annotation et son analyse par bioinformatique est en cours de réalisation. La comparaison de cette séquence génomique avec celles de M. bovis et de M. tuberculosis nous permettra de mieux comprendre les bases de l'atténuation du BCG.

Par ailleurs, la comparaison de certains gènes de différentes souches de M. bovis BCG nous permettra d'établir un schéma évolutif parmi les différentes souches vaccinales utilisées.

Dans le but d'obtenir un panel plus complet des membres du complexe tuberculosis, le séquençage d'une souche de Mycobacterium microti (également utilisée en tant que vaccin) a été initié.

Cette approche ouvre des perspectives pour identifier les gènes responsables de la spécificité d'hôte - M. bovis infectant principalement les animaux et M. tuberculosis étant l'agent infectieux chez l'homme -, étudier les variations antigéniques et expliquer les différences observées dans les voies métaboliques.

Analyse génomique et post-génomique de Mycobacterium ulcerans (Emmanuelle Coutanceau, Caroline Demangel, Laurent Marsollier, Gilles Reysset)

Mycobacterium ulcerans, pathogène émergent à l'origine de l'ulcère de Buruli qui cause des lésions cutanées chroniques et nécrosantes, s'avère être une cause importante de morbidité à travers le monde. Sa prévalence en Afrique de l'Ouest a considérablement augmenté depuis les années 1980. L'ulcère de Buruli est considéré comme la troisième maladie mycobactérienne la plus répandue chez les sujets immunocompétents, après la tuberculose et la lèpre. Contrairement aux autres pathogènes mycobactériens, M. ulcerans est majoritairement extracellulaire, bien que des modèles d'infection dans la souris suggèrent l'existence d'une vie intracellulaire transitoire. M. ulcerans produit une toxine lipidique, la mycolactone. Cette molécule, en plus de son pouvoir cytotoxique, aurait des fonctions immunosuppressives. On a actuellement recours à de multiples approches (génomique, post-génomique et immunologique), pour mieux comprendre la biologie et la virulence de cette bactérie, et trouver de nouveaux moyens prophylactiques et thérapeutiques pour la combattre.

Le séquençage complet du génome de M. ulcerans a fourni de nombreuses informations concernant la physiologie de M. ulcerans, ainsi que sur le mécanisme de production de mycolactone. Nous avons découvert que le génome de M. ulcerans est constitué d'un chromosome et d'un plasmide circulaire de 174 kb, pMUM001. Ce plasmide porte un ensemble de gènes codant pour des enzymes géantes, les polykétides synthases (PKS), dont la fonction biologique est la production de mycolactone. On peut supposer que l'émergence de M. ulcerans en tant que pathogène humain est sans doute le résultat de l'acquisition récente de pMUM001 par transfert horizontal.

Différentes études épidémiologiques ont démontré que l'homme se contaminerait dans l'environnement hydrotellurique. Au laboratoire, nous avons montré que des punaises aquatiques (Les Naucoris) pouvaient être un vecteur de M. ulcerans, seule mycobactérie pouvant se multiplier dans les glandes salivaires de ces punaises d'eau sans créer de dommages tissulaires apparents. Afin d'élucider les processus de colonisation des glandes salivaires des punaises par M. ulcerans, une étude à l'échelle cellulaire a été réalisée. Elle a permis de montrer que les bacilles colonisent les punaises lors de l'ingestion de proies hébergeant des bacilles. Une fois dans la cavité du tube digestif, les bacilles franchissent la muqueuse digestive et sont phagocytés par les plasmatocytes de l'hémolymphe. Ceux-ci transportent les bacilles jusqu'aux glandes salivaires, lieu de la multiplication bacillaire. Le rôle de la mycolactone dans cette colonisation semble primordial, puisqu'un mutant dépourvu de cette toxine est incapable de se maintenir dans les glandes salivaires de l'insecte.

Régulation de la toxinogénèse chez les Clostridies (Bruno Dupuy, Susana Matamouros, Ana Maceira Antunes)

Le pouvoir pathogène des Clostridies responsables d'infections importantes tant en médecine humaine que vétérinaire, [colites pseudomembraneuses et diarrhées post-antibiothérapiques (Clostridium difficile), gangrène gazeuse (C. perfringens), botulisme (C. botulinum) et tétanos (C. tetani)], repose essentiellement sur la capacité de ces organismes à produire des exotoxines. Nous avons montré que la transcription des gènes codant pour ces toxines est sous le contrôle de facteurs sigma alternatifs spécifiques. Ainsi TcdR, UviA, BotR et TetR, régulent respectivement l'expression des toxines A et B de C. difficile, de la bactériocine de C. perfringens, de la toxine botulinique et de la toxine tétanique. Les faibles homologies de séquences qui apparaissent entre ces facteurs sigma et les membres des familles des facteurs sigma parfaitement définies, ne permettaient pas de les classer au sein de l'une d'entre elles. La caractérisation biochimique de leur rôle respectif dans la régulation des toxines, et la mise en évidence récente de l'interchangeabilité fonctionnelle de chacun d'entre eux, nous ont permis de confirmer l'hypothèse selon laquelle ces facteurs sigma constitueraient un nouveau sous groupe de la famille des 70 d'E. coli (désigné groupe V ou TcdR sub family).

Dans la majorité des cas, l'expression des toxines et leurs facteurs sigma correspondants, sont sous le contrôle d'un certain nombre de facteurs de l'environnement (sources carbonées, sources azotées, température, etc..) et varient au cours du temps. Contrairement à ce que l'on observe pour la régulation des toxines, la majorité des facteurs sigma du groupe V sont nécessaires mais pas suffisent pour réguler leur propre expression et seraient sous le contrôle de facteurs de régulation spécifiques. Ainsi, la production des toxines en réponse aux changements de l'environnement dépendrait directement de la régulation de l'expression des facteurs sigma. Chez C. difficile, plusieurs facteurs de régulation pouvant intervenir sur l'expression et/ou la stabilité de TcdR sont actuellement étudiés. Il s'agit des protéines homologues aux protéines CcpA et CodY de B. subtilis, respectivement responsables de la répression des gènes par les sucres PTS et de plus d'une centaine de gènes en phase exponentielle de croissance; de deux systèmes homologues au système senseur/régulateur à deux composants VirS/VirR de C. perfringens, impliqués directement ou indirectement dans la régulation d'un grand nombre de toxines, et de la protéine TcdC de C. difficile dont l'activité anti-sigma est en cours de caractérisation.

Les traitements utilisés contres les infections aux clostridies pathogènes, reposent généralement sur l'utilisation, parfois massive, d'antibiotiques. L'apparition de plus en plus fréquente de souches résistantes et l'implication de l'antibiothérapie dans les récidives à C. difficile nous a conduit à rechercher de nouvelles cibles permettant l'élaboration d'inhibiteurs puissants capables de contrôler l'initiation et/ou l'établissement de ces organismes lors des infections. Parmi les cibles potentielles qui permettraient de produire de tels inhibiteurs, nous travaillons sur des protéines holin-like, qui sembleraient être impliquées dans la sécrétion des toxines, et sur la fonction et le pouvoir antigénique de quatre protéines membranaires CBP, (Choline Binding Protein), affines aux résidus cholines.

Mots-clés: Génomique fonctionnelle, complexe Mycobacterium tuberculosis, lèpre, ulcère de Buruli, Clostridies


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