Unité: Immunophysiologie et Parasitisme Intracellulaire

Responsable: MILON Geneviève

Dans notre Unité sont analysés et caractérisés, à l'échelle tissulaire, cellulaire, subcellulaire et moléculaire, des processus qui rendent compte des interactions renouvelées et durables que des parasites eucaryotes unicellulaires établissent chez les organismes " hôtes " dont dépend strictement leur pérennité. Si l'identification et la caractérisation des traits de vie des parasites du genre Leishmania restent les objets essentiels de nos études, il importe de noter que sont également étudiés des traits de vie de Toxoplasma gondii et de Plasmodium falciparum, ce dans le cadre de collaborations qui seront brièvement précisées dans les deux derniers paragraphes de ce rapport. Toutes ces explorations révèlent que les parasites sont de remarquables " sondes vivantes " pour appréhender et caractériser (a) des propriétés basales et de remodelage des tissus des hôtes - lignages cellulaires leucocytaires et lignages intrinsèques du tissu étudié, matrice extracellulaire - toutes ces entités étant détournées comme substrats de niches (a) où ces parasites se développent et/ou persistent, (b) d'où une partie de leur descendance est transmissible à un autre hôte.

Les leishmanies sont des organismes parasites dont la pérennité dépend de deux autres organismes vivants (1) un insecte hématophage, la femelle phlébotome adulte, (2) un mammifère sans le sang duquel la pérennité des populations de ces insectes serait interrompue. Chez l'insecte, le développement des parasites a lieu dans l'espace luminal et transitoirement pariétal du tube digestif. Au sein de cette niche tissulaire, les leishmanies sont extracellulaires et sont désignées par le terme "promastigotes". Au terme d'un cycle de prolifération au cours duquel elles sont attachées à la membrane apicale des cellules épithéliales du tube digestif, elles se détachent et se différencient en promastigotes métacycliques, les seuls stades de développement qui s'établissent rapidement chez l'hôte mammifère. Nous analysons et caractérisons les interactions dynamiques et durables que les promastigotes métacycliques et leur descendance établissent chez des souris de laboratoire, hôtes chez lesquels les leishmanies détournent des leucocytes phagocytaires professionnels comme cellules hôtes et/ou comme cellules navettes. En outre est criblée la validité de nouveaux modèles pour appréhender un processus trop négligé, bien qu'essentiel à la pérennité des leishmanies, celui de leur transmission de l'hôte mammifère à l'insecte hôte et vecteur. Toutes ces explorations traduisent notre volonté d'identifier les traits de vie des leishmanies per se et elles alimentent des collaborations visant à caractériser, à l'échelle tissulaire, les trais de vie d'autres parasites protozoaires - Toxoplasma gondii et Plasmodium falciparum.

Les leucocytes dendritiques de souris hébergeant Leishmania amazonensis : exploration à haut débit des signatures de l'établissement silencieux du parasitisme et/ou de leur subversion comme cellules navettes les transportant du tissu originel où elles sont inoculées vers les tissus distants (H. Lecoeur, T.Lang, J. Osorio depuis le 1/12/05, J.C. Antoine ® février 2005,  G. Milon, E. Prina).

Le processus d'entrée des promastigotes métacycliques et des amastigotes de Leishmania amazonensis puis leur développement sont analysés avec des populations soigneusement caractérisées de leucocytes dendritiques/LD dérivés de précurseurs médullaires de souris BALB/c ou C57BL/6. En fonction de la présence ou non des leishmanies au sein d'une vacuole, outre la comparaison des transcrits de cytokines, de chimiokines et de leurs récepteurs, a été, est et sera comparé le répertoire de transcrits qui signent la re-programmation des LD induite par le développement du parasite. Seront tout particulièrement dégagées, à l'échelle des protéines (a) les signatures Leishmania - dépendantes des voies d'apoptose ou, au contraire, de survie prolongée des LD, (b) les molécules de la membrane plasmique qui confèrent ou non à ces LD leurs propriétés à " activer " des lymphocytes T ou qui leur confèrent les fonctions de navettes transportant les parasites vers des tissus distants du site où ils ont été originellement phagocytés. Soulignons que le terme " activer " peut référer aussi bien à la programmation de lymphocytes régulateurs - contre-inflammatoires - qu'à celle de lymphocytes T pro-inflammatoires. Pour ces explorations, ont été définies et validées des méthodes d'analyse quantitative [analyse du transcriptome avec la technologie Affymetrix (collaboration avec J.-Y. Coppée et B. Regnault PF2), PCR quantitative en temps réel, détection simultanée de plusieurs analytes avec l'équipement Luminex/Bioplex] et des conditions de tri des LD hébergeant des leishmanies dans des conditions optimales de bio-sécurité [co-élaboration soigneuse du cahier des charges avec H. Kieffer , S. Shorte A.M. Balazuc (Plate-Forme Cytométrie au sein de l'Imagopôle), M. Athurion et M.L. Mousel (Département Santé au Travail)].

Le parasitisme à l'échelle tissulaire : de l'analyse in vivo, ex vivo à l'imagerie en temps réel [C. Deblanc, H. Lecoeur, G. Milon, T. Lang - collaboration avec la Plate-Forme d'Imagerie Dynamique (M.-A. Nicola, S. Shorte), avec le Pôle de Recherche Biomédicale (G. Morizot, P. Buffet) et avec J. Blackwell (Cambridge, Royaume-Uni)].

Pour tenter de caractériser les processus " discrets " via lesquels les leishmanies s'établissent et persistent, in vivo, dans le derme de leurs " hôtes " mammifères, nous avons tenu compte de propriétés de l'écosystème naturel au sein duquel circulent les leishmanies. Chez leurs hôtes et vecteurs - des phlébotomes femelles hématophages - après une phase d'expansion de la population des promastigotes au contact des cellules épithéliales de l'intestin moyen, il y arrêt des processus de division cellulaire et différenciation en promastigotes métacycliques qui, soit persistent dans un gel au niveau le plus antérieur de la lumière de l'intestin moyen, soit atteignent la partie en aval d'une valve un espace où est détectable, autour des promastigotes métacycliques, du protéophosphoglycane filamenteux d'origine parasitaire. Quel que soit le site à partir duquel sont régurgités ces promastigotes métacycliques, le nombre déposé dans le derme superficiel de l'hôte, source de sang, est estimé entre 10 et 1.000/sondage/repas sanguin. Aussi, inoculons-nous un inoculum faible (100, 1000 au maximum 10.000) de promastigotes métacycliques, soit de L. amazonensis, soit de L. major dans le derme - au centre - de l'oreille de souris C57Bl/6 ou BALB/c.

Plusieurs processus sont analysés : outre l'absence, la présence de signes cliniques, leur guérison ou non au site d'inoculation des parasites, sont estimées les charges parasitaires, d'une part dans le site d'inoculation, mais aussi dans le ganglion lymphatique drainant, et des tissus cutanés distants glabres ou non (bord de l'oreille ipsilatérale, oreille contra-latérale, queue...). Il importe de noter qu'au site d'inoculation de L. major chez C57Bl/6 se déploie une séquence d'événements discrets que nous pouvons décrire qualitativement et quantitativement comme suit : (a) au sein de macrophages du derme, la différenciation des promastigotes en amastigotes, (b) une phase d'expansion de la population des amastigotes au sein de leucocytes phagocytaires mononucléés, dont l'origine locale ou non et les propriétés vont enfin pouvoir être étudiées grâce à l'acquisition du cytomètre analyseur trieur FACSAria et la disponibilité de souris transgéniques dont les leucocytes phagocytaires sont aisément détectables - transgènes codant pour la GFP, ou YFP en amont de promoteurs pertinents. Au terme de ces deux étapes cliniquement silencieuses se déploie transitoirement une phase de réduction importante de la charge parasitaire, un processus couplé à un recrutement de leucocytes non T non B (monocytes, neutrophiles, éosinophiles, leucocytes dendritiques) initié par l'extravasation, dans le territoire extra-vasculaire du derme, de lymphocytes T CD4 et CD8. Il semble que le recrutement et le renouvellement de ces lymphocytes CD4 et CD8 traduisent un processus d'activation initié dans le ganglion lymphatique drainant dès que des leucocytes abritant des amastigotes cultivables/viables atteignent cet organe lymphoïde secondaire. De nouvelles méthodes ont été soigneusement définies pour caractériser quels sont - parmi les différents lignages leucocytaires potentiellement "détournables" comme des leucocytes navettes (leucocytes dendritiques, polynucléaires neutrophiles, voire éosinophiles…) - ceux qui le sont ou pas, ce en distinguant deux destinations : (1) le ganglion drainant, (2) les sites cutanés distants. Notons que dans les sites cutanés distants atteints par des leishmanies dont l'effectif de la population reste stable et faible, aucun signe clinique n'est perceptible. L'étude des processus d'établissement durable d'une population parasitaire - dont l'effectif est stable - dans un site cutané cliniquement muet, est en cours. Pour ce faire, des leishmanies (L. major, L. amazonensis) transgéniques ont été construites (gènes codant pour des protéines naturellement fluorescentes ou pour la luciférase d'une part, gène "suicide" d'autre part). Les leishmanies exprimant la luciférase sont précieuses pour l'imagerie in vivo en temps réel, une méthode qui a aussi des applications remarquables pour cribler (a) de nouvelles modalités de traitement - par exemple l'importance de pansements occlusifs - des leishmanioses cutanées (collaboration avec les Drs. G. Morizot et P. Buffet), (b) des préparations vaccinales (collaboration avec J . Blackwell, Cambridge, Royaume-Uni).

Le parasitisme à l'échelle tissulaire: Toxoplasma gondii atteint le parenchyme cérébral de souris vià des leucocytes mobiles que ce parasite détourne comme cellules navettes [collaboration avec S. Darche et D. Buzoni (Département de Parasitologie, Institut Pasteur) et avec N. Courret, P. Sonigo, I. Tardieux (Département Maladies Infectieuses, Institut Cochin, Paris), G. Milon].

Des zoites de Toxoplasma gondii détournent des leucocytes mobiles comme cellules navettes : cette hypothèse énoncée par G.M,, il y a dix ans, a enfin pu être validée : en utilisant des souris de laboratoire auxquelles sont inoculées dans la lumière de l'estomac des kystes de T.gondii, la dissémination des parasites présents au sein de leucocytes mobiles, a été criblée depuis le tissu où a lieu la translocation des tachyzoites - l'iléon - jusqu'au territoire extravasculaire du parenchyme cérébral où ces tachyzoites perçoivent et traitent des signaux qui se traduisent par leur différenciation en bradyzoites au sein de la structure émergente et complexe qu'est le kyste parasitaire.

Le parasitisme à l'échelle tissulaire : le destin des globules rouges humains hébergeant Plasmodium falciparum au sein de la rate humaine isolée perfusée [collaboration avec O. Puijalon, P. David (Département de Parasitologie, Institut Pasteur), V. Brousse, I. Safeukui, P. Buffet (Pôle de recherche biomédicale Institut Pasteur Paris) et collaboration au sein d'une Alliance financièrement aménagée par le Pr F. Shi (National University of Singapore), alliance qui a permis l'articulation entre trois Institutions : MIT/NUS/IP, G. Milon].

Après leur sortie de la moelle osseuse, tissu où ils sont renouvelés, les globules rouges - cellules anucléées dépourvues d'endo-membrane - sont régulièrement criblés pour - entre autres paramètres - le maintien de leurs propriétés mécaniques /de déformabilité, des propriétés qui témoignent de l'extrême plasticité de leur cytosquelette cortical, de la présence de canaux ioniques au niveau de la seule membrane qui persiste, ie la membrane plasmique. Ces globules rouges sont détournés comme cellules hôtes par P.falciparum : après une étape d'invasion rapide du globule rouge par le mérozoite, il y a perte de polarité de ce zoite, un processus au cours duquel les globules rouges continuent à être biconcaves et à circuler. Puis le développement du nouveau programme génétique du zoite se traduit par des propriétés d'adhérence des globules rouges aux cellules endothéliales des microvaisseaux, voire à des composants matriciels péri-cellulaires. La disponibilité de rates humaines saines a permis de valider un système de perfusion qui maintient (a) leur structure et (b) des propriétés physiologiques des compartiments parenchyme de la pulpe rouge/endothélium du sinus veineux, ce dernier compartiment étant le lieu où les globules rouges subissent l'ultime contrôle de leur intégrité fonctionnelle. Toutes ces données nous ont permis d'affiner l'énoncé de questions sur les propriétés physiologiques de déformabilité des globules rouges et d'en formuler de nouvelles en cours d'explorations avec nos Collègues au MIT à Singapour/NUS et au sein de notre Département (respectivement S. Suresh, K. Tan/CT Lim, M. Diez, S. Bonnefoy et P. David).

Mots-clés: Leishmania spp., Immunophysiologie, Parasitisme intracellulaire, Biologie du développement des parasites, Transmission et propriétés invasives des parasites, Pérennité, Parasitisme à l’échelle tissulaire


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