Unité: Immunologie Structurale

Responsable: BENTLEY Graham

Nos projets de recherches sont axés sur la biologie structurale de protéines provenant d'agents infectieux. La détermination et l'analyse de structures tridimensionnelles par les techniques de radiocristallographie sont les activités principales de l'unité ; pourtant, d'autres approches, comme l'immunochimie et les études de cinétiques, s'ajoutent à nos études sur le rapport structure/fonction de protéines. Certains de nos projets concernent des protéines impliquées dans le développement de vaccins ou de médicaments. Une grande partie de nos intérêts se concentre sur les antigènes de surface du Plasmodium qui sont de candidats vaccinaux contre le paludisme. Plus de renseignements sur nos projets peuvent être trouvé sur notre site web : www.pasteur.fr/recherche/unites/ImmStr/accueil.html

Apical Membrane Antigen 1: (G. Bentley, M.L. Chesne-Seck, G. Faure, S. Igonet, F. Saul, B. Vulliez-Le Normand en collaboration avec A. Thomas, Biomedial Primate Research Centre, Rijswijk, Pays Bas, et M. Blackman, National Institute of Medical Research, Mill Hill, R.U.)

Apical Membrane Antigen 1 (AMA1), une protéine trans membranaire de type I, joue un rôle clé dans l'invasion de la cellule hôte par le parasite Plasmodium. La fonction au niveau moléculaire n'est pas connue, néanmoins plusieurs indications expérimentales suggèrent que la protéine interagit avec un récepteur. En particulier, des anticorps induits pas la région ectoplasmique d'AMA1 peuvent inhiber l'invasion par le parasite. AMA1 est un candidat vaccinal en cours d'essais cliniques.

La structure tridimensionnelle de la région ectoplasmique d'AMA1 de l'espèce P. vivax a été déterminée jusqu'à 1.8 Å de résolution. La structure comporte trois domaines, dont Domaines I et II obnt un repliement apparenté au motif PAN (Plasminogen-Apple-Nematode). Le motif PAN se trouve souvent dans des protéines avec une fonction d'adhésion, se liant aux récepteurs protéiques ou saccharidiques, ce qui est compatible avec le rôle putatif d'AMA1.

Un modèle AMA1 de P. falciparum a été dérivé par homologie à partir de la structure cristalline de PvAMA1. Ceci a permis une analyse de la distribution des sites polymorphes de la protéine homologue de P. falciparum. Les sites polymorphes sont repartis sur les trois domaines de PfAMA1 avec la fraction la plus importante localisée sur le Domaine I. Cependant, la distribution de ces sites est biaisée d'un côté de la molécule, ce qui suggère que cette surface est exposée vers extérieur et/ou que des contraintes fonctionnelles intervient à la face moins polymorphe. Les données actuellement disponibles sur le polymorphisme de PvAMA1 sont restreintes au domaine I, mais la tendance est similaire à celle de PfAMA1.

L'épitope reconnu par l'anticorps inhibiteur 4G2, spécifique au PfAMA1, a été analysé par des études de mutagenèse (M. Blackman, N.I.M.R., Mill Hill, R.U.). Cette étude a localisé l'épitope à la base d'une boucle de 40 résidus présente à la surface du Domaine II. Cette boucle est dépourvue de tous polymorphismes connus et, en plus, elle porte un épitope T ; ces observations peuvent être utiles pour l'optimisation de AMA1 comme candidat vaccinal.

Nous avons cristallisé PvAMA1 sous forme de complexe avec le fragment Fab de l'anticorps monoclonal F8.12.19 et déterminé sa structure jusqu'à 2.6 Å de résolution. L'épitope se trouve sur le Domaine III et le caractère conservé des interactions anticorps/antigène explique la réactivité croisée de cet anticorps avec P. falciparum, P. berghei, P. knowlesi et P. cynomolgi. Les études cinétiques sur la liaison de F8.12.19 avec PvAMA1 et PfAMA1, fait par résonance plasmonique de surface, donnent une constante de dissociation apparente de 1 nM et 100 nM, respectivement.

P. falciparum Erythrocyte Membrane Protein 1 (PfEMP1): (C. Badaut, G.A. Bentley, S. Igonet, H. Souchon in collaboration avec O. Puijalon, Immunologie Moléculaire des Parasites, I.P., M. Klinkert, Bernhard Nocht Institut, Hamburg, P. Deloron, Institut de Recherche pour le Développement, Université Paris V)

Dans le globule rouge infecté, P. falciparum exprime le facteur de virulence PfEMP1, protéine membranaire qui est exportée et présentée à la surface de la cellule hôte. Les variants de PfEMP1 forment une famille d'adhésines qui confèrent à l'érythrocyte infecté la capacité de s'auto-agglutiner, d'adhérer à d'autres érythrocytes sains (rosetting) ou d'être séquestré par les cellules endothéliales vasculaires de différents tissus. Elles sont codées par des gènes appartenant à la famille var, représentée par environ 60 copies par génome selon la souche du parasite. Cependant, seul un variant de la protéine est présenté à la surface du globule rouge infecté, ce qui donne aux différentes souches parasitaires diverses spécificités de séquestration. Les différents variants de PfEMP1 portent un nombre variable des domaines DBL et CIDR appartenant aux différentes classes qui confèrent à la molécule, et donc l'érythrocyte infecté, leur spécificité aux différents récepteurs. Nous étudions les propriétés structurales et fonctionnelles de ces domaines provenant de différents variants du PfEMP1.

Nos intérêts sont ciblés sur deux variants de PfEMP1, l'un impliqué dans le "rosetting" (collaboration avec O. Puijalon) et l'autre impliqué dans le paludisme gestationnel (collaboration avec M. Klinkert et P. Deloron). PfEMP1 étant de grand poids moléculaire (250-350 kDa), seuls les domaines individuels sont exprimés pour des études structurales et fonctionnelles. Ces domaines recombinants sont produits dans le système d'expression cellules d'insectes/baculovirus.

Le paludisme gestationnel est la conséquence de la séquestration placentaire d'érythrocytes infectés. Les souches placentaires expriment des variants de PfEMP1 spécifique au chondroïtin sulphate A (CSA) présent sur de protéoglycanes, tels que CSPG et thrombomoduline. La spécificité au CSA semble être due, en partie, à un sous groupe de domaines DBL de classe γ. Nous avons exprimé en grande quantité le domaine DBL3γ provenant de la souche placentaire 732. Ce domaine recombinant interagit avec le CSA et des préparations placentaires de CSPG de façon spécifique, et les anticorps induits par le DBLγ-732 recombinant peuvent bloquer la fixation de cette protéine au CSA. D'ailleurs, le sérum des femmes atteintes du paludisme gestationnel reconnaît le domaine recombinant, ce qui montre la présence des épitopes universels dans les souches placentaires.

Mots-clés: biologie structurale, radiocristallographie, reconnaissance antigénique, structure d’anticorps, antigènes de Plasmodium


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