Unité: Immunophysiopathologie Infectieuse

Responsable: Pierre-André CAZENAVE

Les activités de recherche de l'Unité concernent l'immunophysiopathologie d'infections parasitaires : maladie de Chagas et paludisme en parallèle avec des études plus fondamentales portant sur les répertoires immuns.

La TcPRAC : proline racémase eucaryote mitogène B de T. cruzi (P. Minoprio). Nous avons montré précédemment que les gènes codant pour la TcPRAC sont essentiels à la survie de T. cruzi, car les parasites portant une mutation fonctionnelle de TcPRAC (TcPRAC ‘Knock down') ne sont pas viables. Nous avons étudié le rôle des différentes isoformes de la proline racémase par l'utilisation d'outils moléculaires et la transgénèse du parasite. Nous avons mis en évidence que les formes non infectantes du parasite ayant intégré un vecteur d'hyper expression des gènes de TcPRAC montrent une métacyclogenèse plus importante et se différentient davantage en formes infectantes. Ces parasites mutés présentent une augmentation de leur pouvoir infectieux vers les cellules de l'hôte, suggérant que les TcPRACs puissent jouer un rôle dans les mécanismes de virulence du parasite. Une possibilité serait que TcPRAC, par la transformation de L-proline en D-proline, permettrait l'addition post-traductionnelle de D-proline à des chaînes peptidiques exprimées par le parasite lors de l'infection. Cette hypothèse a été corroborée par nos données récentes qui montrent la présence de D-proline liée à des extraits parasitaires solubles et membranaires. Ces résultats contribueraient à expliquer la capacité du parasite à échapper de la vacuole parasitophore pour se multiplier dans le cytoplasme cellulaire, particulièrement en conférant une résistance à l'action d'enzymes protéolytiques lysosomales. Ces études confirment l'intérêt de la proline racémase comme cible thérapeutique. A partir de nos études fonctionnelles, moléculaires et cristallographiques, nos efforts portent actuellement sur plusieurs axes, notamment a) la modification chimique de l' acide pyrrole carboxylique, inhibiteur des prolines racémases, de façon à le rendre plus soluble, b) l'identification des nouvelles molécules inhibitrices TcPRAC, par des analyses poussées du site catalytique qui impliquent la pharmacodynamique, la modélisation et le criblage virtuel de banques de composés, c) l'identification de protéines parasitaires modifiées par la présence de D-proline et d) la mise en place d'un système d'inactivation moléculaire inductible chez T. cruzi pour l'analyse de nouvelles cibles thérapeutiques.

Etude de la diversité et de la plasticité du Système Immunitaire (A. Six). Une activité importante du laboratoire concerne l'amélioration et la mise en œuvre de techniques d'exploration de la diversité et de la plasticité des répertoires des lymphocytes B et T caractérisés par leur récepteur spécifique d'antigène, immunoglobulines et TCR. En collaboration avec les groupes de S. Pied et P.A. Cazenave, ces techniques sont appliquées à l'étude de la modification des répertoires lymphocytaires en situations physiologiques ou pathologiques, notamment dans le cadre des projets d'étude de maladies infectieuses développés au laboratoire (leishmania, paludisme) chez l'homme et chez la souris. Notre stratégie ISEApeaks est toujours en développement pour raffiner les procédures expérimentales et développer de nouvelles représentations statistiques des répertoires. Nous poursuivons nos analyses de répertoire TCRBV dans des modèle expérimentaux de paludisme : protection contre l'infection par P.yoelii des souris C57BL/6 immunisées avec des sporozoites de P.yoelii irradiés; modèle de neuropaludisme chez les souris B10.D2 infectées par P.berghei. Nous explorons actuellement la perturbation des lymphocytes du cerveau de ces souris par comparaison aux lymphocytes de la rate et du sang afin d'identifier les clones pathogènes ou protecteurs. Parallèlement, en collaboration avec le groupe de Petter Höglund au Karolinska Institutet à Stockholm, nous avons étudié la diversité du TCR de la population de cellules T isolées des ganglions lymphatiques pancréatique (PLN) de souris NOD et observé une utilisation préférentielle apparente de certains TCRBV dans le PLN par rapport aux ganglions lymphatiques inguinaux. Nous avons enfin collaboré à une étude de répertoire TCRBV chez la truite menée par Pierre Boudinot à l'INRA qui a montré que, contrairement à ce qui a été observé chez l'homme et chez la souris, le répertoire des lymphocytes intra-épithéliaux intestinaux est autant diversifié que celui des lymphocytes de la rate.

Une nouvelle population de cellules B péritonéale chez la souris (D. Rueff-Juy). La cavité péritonéale de souris de laboratoire, qui sont toutes issues d'un très petit nombre d'ancêtres, contient une population de cellules B de phénotype a Mac-1+B220lowIgMhigh qui regroupe 2 sous-populations B-1a (CD5+) and B-1b (CD5-). De façon surprenante, la sous-population Mac-1+CD5+ or CD5- B n'a jamais été trouvée dans des sites spécifiques dans d'autres espèces. Notre étude montre la présence d'une nouvelle population de cellules B péritonéales ( population Bw) présente dans la cavité péritonéale des 48 lignées de souris sauvages et des 7 lignées de souris de laboratoire analysées. En revanche, la population B-1a des souris de laboratoire n'est retrouvée que chez la sous-espèce Mus musculus domesticus. Comme la population B-1, la population Bw est localisée essentiellement dans la cavité péritonéale et des expériences de transfert établissent que la différenciation des cellules Bw est dépendante d'un contrôle intrinsèque. Le taux d'Ig sériques est similaire à celui trouvé chez les souris de laboratoire même chez les 2 lignées de souris sauvages dont les cellules B présentent un phénotype non conventionnel et une modification de l'architecture splénique. De plus les cellules Bw stimulées par des ligands de TLR ont des taux d'anticorps anti-phosphorylcholine plus élevés que les B-2 in vitro. L'ensemble de ces résultats montre que la population B-1a n'est pas représentative des cellules B péritonéales chez la souris et suggère fortement que la population Bw, conservée au cours de l'évolution du genre Mus, pourrait jouer un rôle important dans la réponse anti-infectieuse. Les cellules Bw pourraient ainsi servir de lien entre l'immunité innée et l'immunité adaptative.

Immunophysiopathologie du Paludisme (S. Pied). Les travaux menés sur la physiopathologie du paludisme portent sur l'étude des réponses immunes conduisant à l'établissement d'une protection ou d'une forme sévère de la maladie, le neuropaludisme, lors d'une primo-infection par Plasmodium. Ces études sont menées en parallèle dans des modèles expérimentaux murins infectés par P. berghei ANKA (réponses pathologiques) ou P. yoelii (réponses protectrices) et chez l'homme infecté par P. falciparum manifestant différentes formes cliniques de la maladie allant du paludisme asymptomatique au neuropaludisme. Elles visent en particulier à identifier les acteurs de ces réponses effectrices ou pathologiques ainsi que les mécanismes impliqués dans leur induction, maintenance et régulation.

Étude des réponses protectrices qui s'établissent au cours d'une primo-infection par une souche non létale de P. yoelii. Ce volet vise à analyser les bases cellulaires de la réponse immune conduisant à la mise en place d'une protection, en particulier contre les stades pré-erythrocytaires des plasmodies. Dans ce cadre, nous étudions les populations lymphocytaires intrahépatiques telles que les cellules NK T et les cellules NK dans le but de déterminer si ces cellules contribuent à la réponse immune protectrice à l'infection par P. yoelii 265BY induite chez la souris C56BL/6. Afin de nous rapprocher de l'infection naturelle et d'induire le cycle complet du développement du parasite chez l'hôte mammifère, l'infection est initiée avec des sporozoïtes. Plusieurs observations ont été faites de ces travaux: 1) les cellules NKT et NK, isolées du foie et de la rate pendant l'infection, sont activées et présentent des phénotypes et des fonctions effectrices différents dans chaque organe mettant en évidence une compartimentation de la réponse de ces cellules. De plus, ces réponses se décomposent en deux phases, avant et après le 6ème jour de l'infection. Aux jours 6 et 10 p.i., la population NKT est majoritairement constituée de cellules " NKT classiques ", CD4+, spécifiques de CD1d et invariantes. Des cellules DN NKT, au sein desquelles sont présentes des cellules dépendantes de CD1d, invariantes et non invariantes, et des cellules indépendantes de CD1d, sont également activées et augmentées en nombre pendant l'infection. 2) Les cellules NK et NKT du foie contribuent au contrôle de l'infection, mais ne sont pas nécessaires à l'élimination du parasite. Ces populations de cellules NK et NKT d'origine hépatique sécrètent de l'IFN-get du TNFa, cytokines pro-inflammatoires ayant une activité anti-parasitaire. 3) Nous avons aussi mis en évidence une population de cellules T NK1.1+ CD4high présentant un phénotype de cellules NKT " non classiques " et représentant 30 à 40 % des cellules CD4+ dans la rate des souris pendant l'infection. Contrairement aux cellules NKT présentes dans le foie des souris infectées, ces cellules spléniques NKT CD4+ sont non-invariantes, ne présentent pas de biais d'utilisation des chaînes Vb8.1/Vb8.2 et Vb7du TCR et sont indépendantes de CD1d. Le rôle fonctionnel de cette population splénique NK1+ CD4+ au cours de l'infection est en cours d'étude. Par ailleurs, dans le cadre du GPH " Anophele " sont étudiés les effets immunomodulateurs de la salive d'Anopheles Stephensi sur ces réponses protectrices.

Étude des réponses pathologiques associées aux manifestations neurologiques dans le modèle d'infection par P. berghei ANKA. Nous avons précédemment montré que le développement du neuropaludisme chez la souris C57BL/6 est associé à une migration sélective de lymphocytes T CD8+ producteurs de TNF-α ou d'IFN-γ et caractérisés par un répertoire TCRVβ restreint. Afin de mieux comprendre la physiopathologie du neuropaludisme, nous avons d'une part, analysé le rôle joué par les cellules TCD4+ régulatrices dans le contrôle de cette réponse T CD8+. Nos résultats montrent clairement que des cellules T CD4+CD25high Foxp3+ productrices d'IL-10 sont augmentées et activées durant l'infection par P. berghei ANKA. Bien que ces cellules soient capables de supprimer in vitro la prolifération de cellules TCD4 ou CD8 provenant de souris saines ou infectées et stimulées par de l'anti-CD3, elles ne semblent pas contrôler in vivo la réponse CD8 pathogénique. De plus, la déplétion des cellules T CD4+CD25+ régulatrices n'a aucun effet sur la survenue du neuropaludisme. D'autre part, grâce à un modèle in vitro de barrière hémato-encéphalique que nous avons mis au point, nous avons effectué une analyse différentielle du transcriptome des cellules endothéliales, astrocytaires et microgliales après contact avec des cellules T CD8+ provenant de souris naïves ou développant un neuropaludisme (collaboration B. Régnault, Plateforme affymetrix, Institut Pasteur). Cette étude a pour but de mettre en évidence de nouveaux facteurs potentiellement impliqués dans la physiopathologie du paludisme grave.

Étude des facteurs de l'immunité impliqués dans la genèse du neuropaludisme au cours d'une infection à P. falciparum. Nous avons entrepris une étude globale de la réactivité des IgG et IgE circulants contre des antigènes de cerveau humain, de la réponse des anticorps spécifiques du parasite ainsi que du spectre des cytokines plasmatiques chez des cohortes de patients provenant du Gabon (collaboration M. Kombila, CHL Libreville) et de l'Inde (Collaboration G.C. Mishra, NCCS, Pune) ayant développés une infection à P. falciparum asymptomatique, non compliquée ou sévère avec ou sans atteinte neurologique. Les résultats obtenus montrent une association entre le développement du neuropaludisme et une réactivité d'IgG avec un antigène du cerveau de haut poids moléculaire, que nous avons caractérisé par la spectrométrie de masse (collaboration avec A. Namane, Institut Pasteur). Cette réactivité est significativement corrélée à des concentrations plasmatiques de TNFa élevées. Nous avons aussi mis en évidence chez les sujets asymptomatiques, une association entre protection et des réactivité d'IgEs avec deux antigènes du cerveau, différents de ceux associés au neuropaludisme. L'identification de ces antigènes est en cours de réalisation. Ces résultats suggèrent fortement la participation de facteurs auto réactifs dans les mécanismes immunitaires associés à la protection ou la pathologie au cours du paludisme.

Déterminisme génétique de la résistance à des formes graves du paludisme expérimental à P. berghei ANKA (P. A. Cazenave, S. Pied). Nous avons montré l'association du phénotype de résistance au neuropaludisme à deux régions localisées respectivement sur les chromosomes 1 et 11. Au cours de cette étude, un phénotype inattendu et inconnu de résistance à la mort par hyperparasitémie a été découvert et nous avons montré son association à trois régions respectivement sur les chromosomes 1, 4 et 9. Des souris C57BL/6 congéniques soit pour la région du chomosome 1, soit pour celle du chomosome 11 viennent d'être obtenues, nous disposerons dans peu de temps de la congénique au chomosome 9 et de la double congénique aux chomosomes 1 et 11 (collaboration avec le laboratoire du Prof.D. Holmberg, Université d'Umea, Suède).

Un nouveau modèle murin de sensibilité à la leishmaniose cutanée (L.major) (P. A. Cazenave). Nous avons montré que les souris appartenant à la lignée PWK sont sensibles à la leishmaniose cutanée à L. major. Elles développent une forme de la maladie qu'elles contrôlent, celle-ci étant caractérisée par une réponse immune présentant un profil mixte Th1/Th2 où l'IL-10 joue un rôle décisif aggravant. Elles acquièrent aussi une résistance à une seconde infection. Ces caractéristiques sont proches de celles observées chez l'homme infecté par L. major. Cette lignée de souris apparaît ainsi comme un modèle de choix pour la pathologie humaine (collaboration étroite avec les laboratoires des Pr. K. Dellagi et H. Louzir, Institut Pasteur de Tunis, dans le cadre d'un PTR).

Mots-clés: Système immunitaire, immunophysiopathologie, répertoires T et B, maladie de Chagas, paludisme, mitogène, neuropaludisme, TLR, génétique


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