Unité: Immunogénétique Cellulaire

Responsable: THEZE Jacques

L'infection par le VIH conduit progressivement à un déficit immunitaire important. Une réduction progressive du nombre et de la fonction des lymphocytes T CD4 domine la physiopathologie de l'infection VIH. Les causes de ce déficit sont multiples: déplétion des lymphocytes CD4 par l'infection virale, activation anormale du système immunitaire, baisse des réponses spécifiques contre le virus,….L'Unité étudie les mécanismes cellulaires et moléculaires conduisant à ces dysfonctionnements. Nous concentrons nos efforts sur l'étude de deux cytokines (IL-2 et IL-7) qui jouent un rôle central dans le contrôle du fonctionnement du système immunitaire et qui sont impliquées dans la pathogenèse de l'infection par le VIH. De plus, nos études visent à évaluer le potentiel thérapeutique de ces deux cytokines. Dans ce contexte, nous étudions le mode d'action de l'IL-2 sur les différentes sous-populations lymphocytaires de sujets sains et sur les précurseurs de lymphocytes régulateurs isolés de patients traités par cette cytokine.

1) Bases moléculaires du dysfonctionnement des lymphocytes T dans l'infection VIH (Florence Bugault, Olivier Juffroy, Jean-Louis Moreau et Jean-Hervé Colle en collaboration avec J.-F. Delfraissy, Centre Bicêtre, Assistance Publique-Hôpitaux de Paris)

L'étude de la réactivité des lymphocytes CD4 et CD8 de patients infectés par le VIH révèle des anomalies fonctionnelles importantes apparaissant rapidement après l'infection. Afin de caractériser ces anomalies, nous explorons l'expression et le fonctionnement des récepteurs de l'IL-2 et de l'IL-7 dans différents groupes de patients infectés par le VIH.

L'IL-2 est une lymphokine majeure du système immunitaire. Elle est sous exprimée chez les patients infectés par le VIH. De plus, l'analyse de l'expression des trois chaînes de son récepteur (RIL-2) et de la réactivité à l'IL-2 des sous-populations lymphocytaires nous ont conduit à identifier plusieurs dysfonctionnements de ce système chez les patients. Les lymphocytes CD4, bien qu'exprimant le R-IL-2 ne répondent plus à cette cytokine. Plus récemment, au cours d'un suivi longitudinal d'un groupe de patients, nous avons analysé à partir de lymphocytes T CD8, les signaux de transduction induits par l'IL-2. Chez ces patients virémiques, les lymphocytes CD8 purifiés sont incapables d'activer la voie de signalisation Jak/STAT. Notre étude apporte donc une nouvelle catractérisation des anomalies moléculaires qui caractérisent les lymphocytes des patients infectés par le VIH.

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L'IL-7 est une cytokine essentielle contrôlant à la fois la thymopoîèse et l'homéostasie des lymphocytes T périphérique. Nous avons étudié le système de l'IL-7 et de son récepteur chez les patients VIH+. Chez les patients virémiques le taux d'IL-7 sérique augmente et ceci en fonction de l'intensité de la lymphopénie CD4, suggérant l'existence d'une boucle de régulation IL-7/ CD4. Sur les lymphocytes CD4, le niveau d'expression d'expression de la chaîne spécifique du récepteur de l'IL-7 (R-IL-7 alpha ou CD127) est proche de la normale mais sa fonction est altérée conduisant à une réduction significative de la prolifération induite par l'IL-7 et à une diminution de l'induction de la molécule anti-apoptotique Bcl-2. Sur les lymphocytes CD8, on observe une baisse très importante de l'expression du RIL-7 et ceci plus particulièrement sur les lymphocytes CD8 mémoires qui assurent le maintien à long terme de la fonction cytotoxique.

Au cours de l'infection par le VIH, nos résultats montrent l'existence d'un dysfonctionnement de plusieurs systèmes cytokiniques et de leurs voies de signalisation. Au niveau moléculaire, les mécanismes susceptibles d'expliquer ces effets font l'objet de nombreuses études. La glycoprotéine d'enveloppe du VIH (gp120 ) retrouvée dans le sérum et les ganglions des patients séropositifs pourrait jouer un rôle dans ces altérations. L'activation anormale et prolongée du système immunitaire des patients pourrait aussi conduire à une désorganisation de leurs voies de signalisation lymphocytaire. Nos études actuelles devraient contribuer à mieux définir ces anomalies et à comprendre leur origine.

2) Effets de le thérapie anti-rétrovirale (ARV) et potentiel thérapeutique de l'IL-2 et de l'IL-7 chez les patients VIH+ (Florence Bugault, Jean-Louis Moreau, et Jean-Hervé Colle. En collaboration avec J.-F. Delfraissy, Centre Bicêtre, Assistance Publique-Hôpitaux de Paris et M. Morre, Cytheris S.A. Vanves).

A partir d'un certain stade d'évolution de leur maladie, le traitement des patients infectés par le VIH, nécessite l'administration d'ARV. Pour une fraction importante des patients, ce type de traitement présente une efficacité avérée à la fois sur le contrôle de la charge virale et sur la restauration du compte des CD4. Cependant, le traitement n'entraîne pas l'éradication du virus et ne restaure pas des réponses anti-virales efficaces. De plus, les ARV doivent être pris à vie et leurs effets indésirables sont importants. La recherche de nouvelles stratégies thérapeutiques reste un objectif prioritaire. L'utilisation complémentaire de cytokines comme l'IL-2 ou l'IL-7 ouvrent des perspectives pour de nouveaux traitements.

Nous avons vérifié qu'après un traitement ARV prolongé les fonctions des R-IL-2 et des R-IL-7 sont en partie restaurée. De façon intéressante, après six mois de traitement ARV nous avons observé une réversion des défauts de signalisation de la voie Jak/STAT partagée par les récepteurs de l'IL-2 et de l'IL-7. Ceci donne une base moléculaire justifiant l'association thérapeutique des ARV avec des cytokines comme l'IL-2 ou l'IL-7.

Plusieurs essais cliniques ont déjà été réalisés en utilisant de l'IL-2 chez des patients traités par des ARV. Ces essais démontrent la capacité de l'IL-2 à augmenter de façon durable le compte des CD4 tout particulièrement ceux de phénotypes naïfs. Dans un essai clinique de ce type, réalisé avec un groupe de patients qui sous ARV contrôlait bien la charge virale mais restait avec un taux faible de CD4 (< 200 cellules /mm3), nous avons observé que l‘IL-2 faisait apparaître une nouvelle sous-population lymphocytaire CD4+ /CD25+. L'apparition de cette nouvelle population lymphocytaire semble un effet majeur du traitement IL-2 comme l'a montré C. Lane (NIH, USA). Les mécanismes par lesquels l'IL-2 permet l'émergence de cette sous-population restent à préciser. Nous poursuivons la caractérisation de la population lymphocytaire CD4+/CD25+ dans le cadre du GPH VIH/SIDA (voir ci-dessous). Par ailleurs, nous avons montré que l'IL-2 induisait rapidement une élévation du taux plasmatique de deux cytokines thymopoïétiques, l'IL-7 et Flt-3L. Ceci suggère qu'au cours de l'immunothérapie, l'IL-2 suscite une production de lymphocytes au niveau central.

Compte tenu de ses propriétés lymphopoïétiques, l'IL-7 a un potentiel thérapeutique important. En effet, chez des patients immunodéficients, elle devrait pemettre d'élargir le répertoire et d'augmenter les réponses spécifiques des lymphocytes T. Dans un groupe de patients VIH+, nous avons suivi de manière longitudinale le taux d'IL-7 plasmatique, avant et pendant un traitement par des ARV. Une corrélation positive a été démontrée entre le taux d'IL-7 précédent le traitement et le niveau de restauration des CD4 au cours du traitement ARV. Ceci suggère une implication de l'IL-7 dans le contrôle du compartiment des lymphocytes CD4 chez les patients séropositifs. Cette étude indique aussi que sous ARV, un traitement par l'IL-7 devrait favoriser la restauration des CD4. La réponse à l'IL-7 étant en partie réglée par la modulation négative de son propre récepteur, ce mode de régulation et sa réversibilité sont à l'étude de manière à mieux anticiper les conséquences de son administration in vivo. De plus, nous avons étudié l'effet des ARV sur le fonctionnement normal du RIL-7. Ce travail est mené de manière complémentaire à celui du groupe de F. Barré Sinoussi (Unité de Régulation des Infections Rétrovirale, Institut Pasteur).

3) Récepteur de l'IL-2 : mise en évidence d'une nouvelle forme, mécanismes de transduction du signal et réponses différentielles des sous-populations lymphocytaires (Virginie Mazard-Pasquier, Jean-Louis Moreau, Anne-Hélène Pillet et Thierry Rose)

Trois chaînes alpha, beta et gamma rentrent dans la composition du récepteur de l'IL-2 (RIL-2). Le niveau d'expression de chacune de ces chaînes dépend du sous-type de lymphocytes. Deux formes fonctionnelles du RIL-2 ont déjà été décrites : l'assemblage des trois chaînes produit un récepteur de très haute affinité (Kd = 10pM) alors que les deux chaînes beta et gamma composent un récepteur de moindre affinité (Kd = 1nM). En l'absence de chaîne gamma, nos résultats récents suggèrent l'existence d'une troisième forme du RIL-2, composée de deux chaînes beta. En effet, la construction puis l'expression de chaînes beta hybrides, porteuses d'epitopes HA ou Myc, nous ont permis de démontrer l'existence des dimères beta/beta par co-immunoprecipitation. De même, l'expression de chaînes beta hybrides, fusionnées avec les protéines fluorescentes dérivées de la GFP (beta-CFP ou beta-YFP) nous ont permis d'étudier les interactions de type RIL-2beta/RIL-2beta à la surface de lignées cellulaires transfectées COS et HEK. Par microscopie confocale, nous avons analysé la fluorescence résultant du transfert d'énergie (FRET) d'une sous unité à l'autre après irradiation. Parallèlement, les associations beta/beta ont été modélisées et nous proposons que ce complexe est aussi stable que l'hétérodimère IL-2Rbeta/IL-2Rgamma.

Les lymphocytes NK répondent spontanément à l'IL-2 et de manière très intense. Les chaînes RIL-2beta joue un rôle critique dans l'activation précoce des lymphocytes NK. Comme ces cellules expriment à leur surface de nombreuses chaînes beta mais peu de gamma, nous supposons que les dimères beta identifiés y jouent un rôle physiologique. Nous avons exploré les voies de signalisation activées par le R-IL-2 des lymphocytes NK et isolé le complexe de signalisation utilisé par ces lymphocytes après une stimulation par de l'IL-2. Ce complexe, composé des chaînes RIL-2beta et des kinases JAK3 et STAT5, est dépourvu de la chaîne RIL-2gamma. Ceci démontre la fonctionnalité des dimères RIL-2beta des lymphocytes NK. (en collaboration avec S. Pellegrini).

A la différence des NK, les lymphocytes T ont besoin, pour répondre à l'IL-2, d'être co-activés par un signal provenant de leur récepteur spécifique (TCR). Le rôle de cette co-activation n'est pas encore compris. Elle pourrait conditionner l'expression du RIL-2 de haute affinité ou agir sur les étapes contrôlant l'activation et la division cellulaire caractérisant la réponse à l'IL-2. Pour trancher entre ces deux types d'hypothèses, nous avons étudié des souris transgéniques exprimant de manière constitutive la chaîne RIL-2beta humaine. Leurs lymphocytes CD4 répondent à l'IL-2 par la phosphorylation des STATs et des MAPKs. Cependant, ils ne prolifèrent pas car l'inhibiteur de la division cellulaire p27kipl reste exprimé à un niveau élevé après exposition à l'IL-2. La prolifération à l'IL-2 de ces lymphocytes n'est acquise qu'après répression de p27kipl obtenue après stimulation du TCR. Au contraire, chez les lymphocytes CD8 de souris transgéniques l'inhibition directe de l'expression de p27kipl sous l'influence de l'IL-2 déclenche une prolifération des lymphocytes cytotoxiques, en l'absence de co-stimulation par le TCR. L'expression du RIL-2 est donc suffisante pour déterminer la capacité des lymphocytes T cytotoxiques à répondre à l'IL-2. Par contre, pour les lymphocytes CD4, cette compétence n'est acquise qu'après engagement du récepteur spécifique d'antigène (en collaboration avec F. Gesbert).

4) Grand Programme Horizontal VIH/SIDA : "Gene expression and signaling defects in the pathogenesis of HIV infection"

Six unités et trois plateformes appartenant à différents départements de l'Institut Pasteur ainsi que deux services clinique de l'Assistance Publique - Hôpitaux de Paris sont impliqués dans ce projet organisé en trois sous-programmes. Ce GPH vise à analyser, au niveau des lymphocytes CD4, les gènes et les signaux de transduction impliqués dans lé résistance ou l'évolution vers le SIDA. Il vise aussi à caractériser le mécanisme d'action du traitement par de l'IL-2 de patients VIH+ sous ARV. Il est piloté par un comité comprenant M. Muller-Trutwin, L. Chakrabarti, O. Acuto, L. Rogge, F. Arenzana-Seisdedos. La coordination de l'ensemble est assurée par Jacques Thèze. Notre Unité est directement impliquée dans deux sous-programmes. Nous étudions, d'une part, les lymphocytes CD4 de type mémoire centrale de patients infectés, contrôlant spontanément leurs charges virales (" HIV Controllers ", récemment caractérisés par O. Lambotte et J.-F. Delfraissy). Ces études sont effectuées par S. Potter (boursier du gouvernement australien) et par L. Chakrabarti. D'autre part, avec le laboratoire d'Immunorégulation (L. Rogge) l'exploration du mécanisme de restauration des CD4 après traitement par ARV plus IL-2 a été entreprise en combinant une caractérisation de la population CD4+ /CD25+ purifiée avec une étude de génétique fonctionnelle. Les patients proviennent de l'essai ANRS 118 (Pr Y. Levy)

Mots-clés: HIV, lymphocytes CD4, IL-2, RIL-2, IL-7, RIL-7, récepteurs et signaux de transduction, immunothérapie


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