Unité: Intéractions Bactéries- Cellules

Responsable: Cossart Pascale

Notre unité étudie les bases moléculaires et cellulaires de la pathogénicité de Listeria monocytogenes, un micro-organisme modèle pour l'étude du parasitisme intracellulaire. L. monocytogenes est la bactérie responsable de la listériose humaine, une infection d'origine alimentaire dont la mortalité globale s'élève à 30%. L. monocytogenes traverse les barrières intestinale, hémato-encéphalique et fœto-placentaire et est responsable de gastroentérites, de méningo-encéphalites et d'infections maternofœtales. Elle peut induire son internalisation dans plusieurs types cellulaires non-phagocytaires, y survivre et se multiplier. L. monocytogenes se propulse dans le cytoplasme en polymérisant l'actine à l'un de ses pôles et peut passer de cellule en cellule.

Cette dernière année, nous avons identifié de nouveaux facteurs de virulence de L. monocytogenes, nous avons approfondi notre connaissance des mécanismes moléculaires de l'internalisation, ainsi que celle de la physiopathologie de la listériose, notamment les mécanismes permettant le franchissement des barrières de l'hôte. Nous avons également accompli des progrès significatifs dans la compréhension des mécanismes moléculaires de l'infection cellulaire par Rickettsia conorii, une bactérie intracellulaire responsable la fièvre boutonneuse méditerranéenne.

Nous rappelons ci-dessous les résultats scientifiques principaux de notre laboratoire au cours des dix dernières années:

- Découverte et/ou caractérisation des principaux facteurs de virulence de L. monocytogenes,

- Découverte d'un nouveau type de régulation par un ARN thermosenseur,

- Détermination des séquences complètes des génomes de L. monocytogenes et de L. innocua, une espèce phylogénétiquement proche mais non-pathogène,

- Découverte du récepteur de l'internaline, la E-cadhérine,

- Découverte de plusieurs facteurs cellulaires critiques pour l'entrée dépendante de l'internaline,

- Démonstration des spécificités d'espèces des interactions internaline/E-cadhérine et InlB/Met,

- Identification des voies de signalisation stimulées pendant l'entrée dépendante d'InlB et identification de deux récepteurs d'InlB,

- Elucidation du rôle des radeaux lipidiques (rafts) dans l'internalisation de L. monocytogenes,

- Identification du rôle de la machinerie d'endocytose dans l'invasion bactérienne,

- Découverte du mécanisme utilisé par L. monocytogenes pour polymériser l'actine et se déplacer dans le cytoplasme,

- Découverte de la capacité du virus de la vaccine à polymériser l'actine,

- Identification d'un nouveau nucléateur d'actine produit par Rickettsia conorii,

- Identification du rôle de l'internaline dans le franchissement de la barrière intestinale, et génération du premier modèle transgénique pour une maladie bactérienne humaine,

- Démonstration du rôle de l'internaline dans la listériose humaine par une étude épidémiologique d'une grande collection d'isolats d'origine clinique et alimentaire,

- Identification du rôle de l'internaline pour envahir et traverser la barrière placentaire,

- Identification du premier récepteur cellulaire de R. conorii et de son ligand bactérien,

Cette année, nous avons concentré nos investigations sur l'identification de nouveaux facteurs de virulence de L. monocytogenes, sur l'étude de la biologie cellulaire de l'infection par L. monocytogenes, de la physiopathologie de la listériose, ainsi que la biologie cellulaire de l'infection par R. conorii.

Identification de nouveaux facteurs de virulence de L. monocytogenes

Notre laboratoire avait identifié les principaux facteurs de virulence de L. monocytogenes, notamment la listeriolysine (LLO) qui permet la lyse de la vacuole d'internalisation, ActA, qui permet les mouvements intra- et inter-cellulaires, PlcA et PlcB, deux phospholipases qui jouent un rôle critique pour la lyse de la double vacuole et dans certains cas la vacuole primaire, et enfin des protéines d'invasion majeures, l'internaline (ou InlA) et InlB. Nous avions également identifié et caractérisé la protéine PrfA, le principal activateur de l'expression des gènes de virulence.

Plus récemment, par l'utilisation de la technique de signature-tagged mutagenesis (STM), nous avions également découvert et caractérisé FbpA, une protéine de surface qui lie la fibronectine mais qui joue également le rôle de chaperonne pour LLO et InlB. Cette année, nous avons caractérisé le régulon VirR/VirS, qui contrôle l'expression des gènes impliqués dans la modification des composants de la paroi et de la membrane bactérienne (Mandin, Mol. Microbiol, 2005).

Par des approches de type post-génomique, nous avions identifié Bsh, une hydrolase des sels biliaires qui contribue à la survie bactérienne dans l'intestin, et Auto, une autolysine impliquée dans l'internalisation. En générant une bactérie mutante dépourvue du gène de la sortase A, nous avions démontré que des protéines ancrées à la paroi bactérienne par un motif LPXTG autres que l'internaline contribuent à la virulence de L. monocytogenes. Cette année, nous avons identifié une protéine de cette famille, que nous avons appelé Vip, et qui est impliquée dans l'entrée et la survie bactérienne chez l'hôte infecté (Cabanes, EMBO J. 2005), ainsi qu'InlJ, une protéine de surface qui joue un rôle dans la virulence mais dont la nature précise est en cours d'étude (Sabet, Infect. Immun. 2005). Nous avons également identifié Stp, une sérine/thréonine phosphatase, impliquée dans la réponse au stress, qui déphosphoryle le facteur d'élongation EF-Tu (Archambaud, Mol. Microbiol. 2005). Nous avons enfin démontré le rôle dans la virulence de la ferritine de L. monocytogenes. (Dussurget, FEMS Microbiol. Lett. 2005). La contribution dans la virulence de nouveaux facteurs bactériens ainsi que leur caractérisation moléculaire sont en cours au laboratoire.

La biologie cellulaire de l'infection par L. monocytogenes

Les voies d'internalisation dépendantes d'InlA et InlB sont étudiées au laboratoire.

La voie InlA : Nous avions prouvé que la E-cadhérine est le récepteur d'InlA, et que la connexion de la E-cadhérine aux caténines et au cytosquelette d'actine sont des facteurs critiques pour l'internalisation. Nous avions ensuite mis en évidence le rôle dans le processus d'entrée d'une myosine non conventionnelle, la myosine VIIA, (dont nous avions contribué à démontrer le recrutement aux jonctions adhérentes), ainsi que celui de son ligand transmembranaire, la vezatine. Cette année, au moyen d'un crible par la technique du double-hybride, nous avons identifié et caractérisé ARHGAP10 comme nouveau ligand de l'alpha-caténine, qui le recrute aux jonctions adhérentes et joue un rôle critique dans l'internalisation de Listeria (Sousa, Nat. Cell Biol., 2005).

La voie InlB : InlB est une molécule de signalisation puissante qui déclenche l'entrée dans un grand nombre de types cellulaires. Sa structure tridimensionnelle a été déterminée en collaboration avec P. Ghosh. Nous avions prouvé par une approche d'inhibition pharmacologique que la voie de la PI3-kinase est une voie de signalisation qui joue un rôle absolument critique pour l'entrée. Ceci a mené à l'identification de Met, le récepteur du facteur de croissance des hépatocytes (HGF) comme l'un des trois récepteurs d'InlB. Les deux autres ligands d'InlB sont le gC1qR et les glycosaminoglycanes. Une série de molécules régulatrices du cytosquelette, comme les petites GTPases Rac et Cdc42, Arp2/3 et la cofiline, est critique pour l'entrée. Cette année, nous avons prouvé que les protéines de la famille WASP, Abi1 et Ena/VASP, sont également des médiateurs clés de la voie InlB (Bierne, J. Cell. Sci. 2005).

En outre, nous avons identifié le rôle critique des radeaux lipidiques (rafts) et de la machinerie d'endocytose (Veiga, Nat. Cell Biol. 2005) dans le processus d'internalisation. Ces derniers résultats mettent en valeur que l'endocytose dépendante de la clathrine peut être utilisée pour l'internalisation de particules plus grandes que ce qui était connu précédemment, et illustrent la puissance du modèle Listeria pour étudier des questions fondamentales en biologie cellulaire.

Le travail se poursuit au laboratoire afin de toujours mieux comprendre la microbiologie cellulaire de l'infection par L. monocytogenes, qu'il s'agisse de l'entrée ou des étapes ultérieures de l'infection. En outre, la réponse des cellules à l'infection par L. monocytogenes est étudiée en détail.

Physiopathologie de la listériose

Nous avions prouvé que l'interaction d'InlA avec son récepteur la E-cadhérine est spécifique d'espèce, et que la E-cadhérine de souris, contrairement à la E-cadhérine humaine, n'interagit pas avec InlA. En produisant des souris transgéniques exprimant la E-cadhérine humaine au niveau de la barrière intestinale, nous avions prouvé que la listériose acquise par voire orale peut être mortelle et que l'internaline est un facteur majeur de virulence, qui permet l'internalisation dans les enterocytes in vivo et la translocation de L. monocytogenes au travers de la barrière intestinale. Contrairement à ce qui est observé chez les souris non-transgéniques, les cobayes sont permissifs à L. monocytogenes par voie orale, et ceci corrèle avec la capacité de la E-cadhérine de cobaye d'interagir avec l'internaline. Nous avions également montré, en combinant une approche épidémiologique et l'utilisation de placenta humain infecté, le rôle critique d'InlA dans la capacité de L. monocytogenes à reconnaître et traverser la barrière placentaire. Cette année, nous avons prouvé que l'interaction d'InlB avec ses récepteurs est également spécifique d'espèce, et que cette interaction ne se produit pas chez le cobaye et le lapin, bien que ces espèces soient naturellement permissive à L. monocytogenes (Khelef, Cell. Microbiol, 2006). Dans cette étude, nous avons également démontré que dans les souris transgéniques exprimant la E-cadhérine humain au niveau de l'intestin, InlB n'est pas impliquée dans l'invasion et la traversée de la barrière intestinale. Actuellement, le travail dans le laboratoire se concentre actuel sur les mécanismes moléculaires qui sous-tendent le tropisme de L. monocytogenes pour le système nerveux central. La réponse de l'hôte à l'infection est également étudiée, de même que l'imagerie in vivo et en temps de réel de l'infection chez l'animal.

Biologie cellulaire de l'infection à Rickettsia conorii

En 2005, nous avons contribué de façon significative à la compréhension de la biologie cellulaire de l'infection à Rickettsia conorii. L'année dernière, nous avions identifié RickA, la protéine de R. conorii impliquée dans la polymérisation de l'actine permettant le mouvement intracellulaire de ce micro-organisme. Nous avons focalisé cette année nos investigations sur le mécanisme d'entrée dans l'entrée dans les cellules et avons identifié le récepteur cellulaire de R. conorii, Ku70, une sous-unité de la protéine kinase ADN-dépendante, une protéine normalement impliquée dans une variété de fonctions nucléaires (Martinez, Cell, 2005). Nos efforts actuels se concentrent sur l'étude du mécanisme moléculaire de l'internalisation.

Pour une présentation plus détaillée de nos projets de recherches actuels, dans les trois domaines présetnés ci-dessus, vous pouvez visiter le site internet de l'unité à http://www.pasteur.fr/recherche/unites/uibc/. Celui-ci est mis à jour régulièrement, et présente les différents chercheurs et leurs projets spécifiques.

Photos :

Figure 1: Reconstruction tridimensionnelle d'images confocales montrant le recrutement de clathrine au site d'entrée de L. monocytogenes. Les bactéries extracellulaires apparaissent en bleu et les bactéries intracellulaires en vert. La chaîne lourde de la clathrine endogène est détectée grâce à l'anticorps monoclonal X-22 d'anti-clathrine (Affinity BioReagents). Les reconstructions ont été exécutées à partir de coupes confocales de 0.17um d'épaisseur en utilisant le programme Osirix. (Pour plus de détail, voir Veiga et al, Nat. Cell Biol, 2005, 7:894-900).

Figure 2: Images confocales montrant les marquages en fluorescence d'ARHGAP10, de l'alpha-caténine, et de l'actine dans les cellules Caco-2. Ligne supérieure: ARHGAP10 colocalise avec l'alpha-caténine et l'actine au niveau des jonctions adhérentes, et est également détecté au niveau du noyau et de la région périnucléaire. Ligne inférieure : ARHGAP10 est recruté et colocalise avec l'alpha-caténine et l'actine au site d'entrée de L. innocua exprimant InlA, et aux jonctions adhérentes. Les flèches indiquent l'accumulation des protéines autour des bactéries en voie d'internalisation. (Pour plus de détail, voir Sousa et al, Nat. Cell Biol, 2005, 7:954-60).

Mots-clés: Listeria, Rickettsia, Phagocytose, Endocytose, Barrière, Actine, Mutagenèse, Génomique, Post-génomique, Microbiologie cellulaire


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