Unité: Hépacivirus

Responsable: Eliane MEURS

Notre objectif est d'étudier l'interaction du virus de l'hépatite C (VHC) et de certains de ses composants (nucléocapside) avec sa cellule-cible et avec d'autres molécules de l'hôte (lipoprotéines, immunoglobulines) et d'établir le rôle de ces interactions dans la physiopathologie de l'infection.

Nous étudions la structure et la composition des formes virales circulantes dans le sérum de sujets infectés par le VHC et le mécanisme d'infection de la cellule par ce virus. Nous analysons le rôle des lipoprotéines dans l'entrée du VHC dans la cellule et dans la reconnaissance de récepteurs hépatiques par ce virus.

Nous avons élaboré une stratégie d'indentification et de purification d'hépatocytes humains infectés par le VHC ex vivo, basé sur l'activité de la protéase NS3/4A. Cette technique nous permet d'étudier les caractéristiques de permissivité des cellules au VHC.

Le VHC est capable d'interférer à la fois avec l'induction et avec l'action des IFNs, composants majeurs de la réponse immune de l'hôte. De nombreux patients sont, en effet, non-répondeurs au traitement actuel de référence (combinaison IFN/ribavirine). Nous étudions les mécanismes d'interférence du VHC avec les voies de signalisation cellulaire impliquées dans l'induction de l'IFN, en utilisant un modèle réplicon du VHC et un modèle d'infection de lignées hépatocytaires par le VHC.

ETUDE DU MECANISME D'ENTREE DU VHC DANS LA CELLULE: Interaction avec le récepteur " scavenger " type B classe 1 (SRB1/Cla-1)

Patrick Maillard, Ursula Andréo, Olga Kalinina, Agata Budkowska (Collaborations : Thierry Huby et John Chapman, U 551 Inserm, Hôpital de la Pîtié, Paris ; Patrick Marcellin et Michèle Martinot, Hôpital Beaujon, Paris ; Jean-Michel Pawlotsky , Hôpital Henri Mondor, Créteil)

Plusieurs candidats-récepteurs pour le VHC ont été décrits sur la base de leur réactivité avec la protéine E2 d'enveloppe virale. Néanmoins leur rôle dans l'infection de la cellule cible par le virus natif circulant dans le sérum de patients infectés par le VHC reste à déterminer. Le récepteur " scavenger " humain SR-BI/Cla1 est un récepteur capable d'interagir avec HDL, LDL VLDL et facilite l'efflux de cholesterol vers ces lipoprotéines. VHC circulant dans le sérum de sujets infectés est associé aux différentes classes de lipoprotéines (LDL, VLDL, HDL), et pourrait donc utiliser les récepteurs aux lipoprotéines pour pénétrer dans la cellule. Nous avons mis en évidence que le récepteur " scavenger " humain SR-BI/Cla1, soit exprimé après transfection de gène humain codant ce récepteur dans la lignée CHO, soit naturellement exprimé dans des cellules d'hépatomes humains, est capable de lier et d'internaliser du VHC naturel, provenant de sérums de patients infectés. Cette interaction n'est pas mediée par la protéine E2 d'enveloppe virale, -car elle n'est pas inhibée par les anticorps anti-enveloppe -mais elle est dépendante des lipoprotéines plasmatiques (VLDL) associées aux virus. En effet, les ligands physiologiques de SR-BI/Cla1 comme les LDL et les VLDL ainsi que les anticorps dirigés contre β- lipoprotéines VLDL inhibent in vitro l'entrée virale. Nos résultats suggèrent l'existence d'une voie alternative de l'infection de la cellule par le VHC impliquant les lipoprotéines (VLDL et LDL) associées au virus et les récepteurs de lipoprotéines sur l'hépatocyte: SR-BI/Cla1 et LDL-R. Cette voie pourrait permettre au virus d'infecter les cellule en présence d'anticorps neutralisants et constituerait un mécanisme de subversion du virus à la réponse immune de l'hôte (1) (Figure 1)

Les travaux en cours portent sur le mécanisme de l'infection de la cellule par le VHC, le rôle des lipoprotéines et des autres molécules impliquées dans le métabolisme de lipoprotéines dans l'entrée virale. (2, 3).

1. P. Maillard , T. Huby U. Andreo , M. Moreau J. Chapman , and Agata Budkowska ; Interaction of natural hepatitis C virus with the human scavenger receptor SR-BI/Cla1 is mediated by apo-B-containing lipoproteins FASEB J, Feb, 2006

2. P.André, G. Perlemutter, A. Budkowska, C. Bréchot and V. Lotteau. Hepatitis C virus and lipid metabolism. Seminars in Liver disease 25 (1), 95-1004, 2005.

3. U. Andréo , P. Maillard, M. Martinot, P. Marcellin, and A. Budkowska Manuscrit en preparation.

ETUDE DE La nucleocapside du VHC et DE son role dans la pathogenese de l'infection

Patrick Maillard, Farzin Roohvand, Ursula Andréo, Agata Budkowska (Collaborations : K .Krawczynski, Hepatitis Branch CDC Atlanta Jean Luc Teillaud Inserm U255, Paris, Jean Pierre Lavergne, IBCP, Lyon, Grazyna Faure, IP Paris, Marie Flamand IP Paris, Jacques d'Alayer IP Paris)

Les populations virales circulant dans le sérum de sujets infectés par le VHC restent mal définies et le virion infectieux n'a pas encore été isolé à partir de sérum, ni caractérisé. Nous avons montré que les nucléocapsides virales non-enveloppées du VHC sont présentes dans le sérum de sujets infectés par ce virus (4). (Figure 2) Les anticorps monoclonaux induits par immunisation avec ces particules virales, nous ont permis de détecter la protéine de la capside dans les hépatocytes de chimpanzé au cours de l'infection expérimentale par le VHC (coll avec CDC, Atlanta) (Figure 3).

La production des nucléocapsides non-enveloppées et leur libération à partir des hépatocytes infectés pourrait être un moyen non-conventionnel d'échapper à la réponse immune de l'hôte, et d'induire de multiples effets immunopathologiques dans l'organisme infecté. En effet, les nucléocapsides du VHC, mise à part leur réactivité avec des anticorps spécifiques, ont la capacité de réagir avec le fragment Fcγ des IgG " non-immunes ". Le site " Fcγ receptor-like " formé par la protéine de la capside du VHC mime le récepteur Fcγ humain " néonatal " (FcRn). Les études par SPR (surface plasmon resonans) ont suggéré que la protéine de la capside est capable d'interagir avec un anticorps anti-capside par le mécanisme appelé " bipolar bridging " : par son paratope sur l'epitope viral et par son domaine Fcγ sur le motif FcγR-like (Figure 4). D'autres virus humains (CMV, HSV-1 EBV) produisent également les protéines présentant les propriétés fonctionnelles des FcγRs humains. Celles-ci leur permettraient d'éviter les conséquences effectrices des anticorps, mediées par leur parties Fcγ . La fonction  FcγR-  de sa nucléocapside pourrait offrir au VHC la possibilité d'échapper aux mécanismes de défenses immunitaires médiés par le domaine Fcγ des anticorps anti-capside et/ou d'affecter les fonctions de récepteur FcRn au cours de l'infection par le VHC. (5)

Les travaux en cours portent sur l'interaction de la protéine de la capside avec les cellules hépatiques et les composants du cytosquelette ( 6) .

4. P.Maillard, K. Krawczynski, J. Nitkiewicz, Ch..Bronnert, M. Sidorkiewicz, P.Gounon, J. Dubuisson, G.Faure, R.Crainic and A.Budkowska. Non- enveloped nucleocapsids in serum of HCV infected patients.. J. Virol. 75, 8240-8250, 2001

5 P.Maillard, J-P. Lavergne, S. Siberil , G. Faure, F. Roohvand S. Petres , J-L. Teillaud and A. Budkowska. Fcγ receptor-like activity of Hepatitis C virus core protein J. Biol. Chem. 279, 2340, 2347, 2004 .

6. F. Roohvand, JP Lavergne, U Andréo,J, D'Alayer, and A. Budkowska. manuscrit en préparation..

IMPACT DE LA VARIABILITE DU VHC SUR LE DIAGNOSTIC DE L'INFECTION PAR LE VHC

Olga Kalinina, Patrick Maillard, Agata Budkowska. Collaboration avec IP. Athènes, IP St. Petersbourg, IP Cambodge, IP. Vietnam, IP Cameroun, Institut Cantacuzène (Roumanie). Programme Transversal de Recherche (PTR) #126 coordonné par Pénélope Mavromara (IP Athènes).

En collaboration avec d'autres Instituts du RIIP (Réseau International des Instituts Pasteur), nous étudions l'impact de différents génotypes du VHC, autres que le génotype 1, sur la détection des anticorps anti-VHC dans le sérum de patients. En effet, des génotypes tels que les génotype 4 et 6 du VHC sont fortement prévalents dans l'Asie du Sud-Est, en Centre-Afrique et en Europe de l'Est. Les buts principaux de ce projet sont: (1) d'évaluer l'impact de la variabilité génétique du virus sur la performance des diagnostics de l'infection dans ces parties du monde et (2) de produire des nouveaux réactifs et de développer des nouvelles méthodes pour améliorer les tests diagnostics actuels.

STRATEGIE D'IDENTIFICATION ET DE PURIFICATION DES HEPATOCYTES INFECTES PAR LE VHC .

Adrien Breiman, Damien Vitour, Myriam Vilasco, Eliane Meurs  (collaboration avec Patrick Maurel- INSERM U128, Montpellier, Gilles Duverlie, CHU-Faculté de Médecine, Amiens; Czeslaw Wychowski ; CNRS-FRE 2369 ; IP Lille, ; Pierre Charneau, IP, Paris )

Notre but est d'identifier les cellules infectées par le VHC afin de déterminer les caractères cellulaires de permissivité à l'infection. Pour cela, avons construit une forme chimérique du facteur de trancription Gal4VP16 qui ne s'active qu'en présence de la protéase NS3/4A et permet ainsi l'induction de différent gènes rapporteurs situés sous le contrôle du promoteur (Gal4)5-E1b (par exemple : CAT, GFP et le marqueur de surface H-2 Kκ). (Figure 5). Nous avons inséré le motif de transclivage NS5A/5B du VHC de génotype 1a entre Gal4VP16 et la partie N terminale de la protéine PERK résidente du réticulum endoplasmique (RE) et nous avons démontré que, sous cette forme, il était clivé spécifiquement par NS3/4A. La transfection transitoire de la lignée UHCV-11 inductible pour l'expression de la polyprotéine du VHC de génotype 1a, par cette construction chimérique a démontré la migration spécifique de Gal4VP16 dans le noyau lorsque le VHC est exprimé. L'induction spécifique de gènes par la protéine chimérique a ensuite été démontrée par un test quantitatif, en utilisant le gene rapporteur CAT, d'abord dans les cellules UHCV-11, puis dans des cellules Huh-7 exprimant un réplicon du VHC de génotype 1b. L'utilisation de GFP, comme gène rapporteur, permet également une estimation rapide, par fluorescence, de l'expression du VHC dans les cellules. Le virus de l'hépatite C infecte les hépatocytes humains en culture primaire avec une faible efficacité. En utilisant le marqueur de surface H-2 Kκ comme gène rapporteur et en introduisant les différentes constructions (chimère et gène rapporteur) par voie de transduction, à l'aide de pseudovirus, nous avons maintenant la possibilité de purifier des hépatocytes infectés par le VHC par tri immunomagnétique. Il est cependant difficile d'obtenir des préparations régulières d'hépatocytes ( provenant de résections chirurgicales). Toutefois, le système de tri a pu être validé gràce à la possibilité d'infecter des cellules d'origine hépatocytaire par le VHC de génotype 2a que l'on peut maintenant générer en culture (VHC JFH1). Le système d'activation de la chimère par l'infection a ainsi pu être démontré d'abord en utilisant le gène rapporteur CAT puis en utilisant le gène rapporteur H-2 Kκ et en réalisant un tri sélectif des cellules infectées (Figure 6). Nous allons maintenant déterminer les caractéristiques de ces cellules qui leur permettent de s'infecter par le VHC.

A. Breiman, D. Vitour, M. Vilasco, D. Delgrange, C. Ottone, S. Molina, L. Pichard-Garcia, C. Fournier, P. Charneau, G. Duverlie, C. Wychowski, P. Maurel and E. F. Meurs An HCV NS3/4A protease-dependent strategy for the identification of Hepatitis C Virus-infected cells submitted

INTERACTION DU VHC AVEC LA REPONSE IMMUNE INNEE

Adrien Breiman, Damien Vitour, Myriam Vilasco, Stéphanie Dabo, Eliane Meurs  (Collaboration avec John Hiscott et Rongtuan Lin ; Lady Davis Institute ; Montréal, Can)

A Le rôle antiviral direct de IKKε sur le VHC

Le laboratoire a récemment montré que la protéase NS3/4A du VHC interférait avec deux voies d'induction des interférons par les ARNs bicaténaires, la voie TRIF et la voie RIG-I . Ces voies conduisent, toutes deux, à l'activation des facteurs de transcriptions NF-κ B et IRF3 via les protéines kinase IKKαβ et TBK1/IKKε et on sait maintenant que NS3/4A clive TRIF et qu'elle dissocie RIG-I des kinases situées en aval, en clivant une protéine adaptatrice, Cardif, liée à la mitochondrie (Figure 7). En utilisant un modèle réplicon du VHC, nous avons montré que la surexpression d'IKKε inhibe l'expression virale, en accord avec sa localisation en aval de l'inhibition par NS3/4A . Dans ces conditions, nous avons établi par microarray le transcriptome induit par IKKε dans le modèle réplicon et nous avons montré une forte induction de gènes connus pour être également induits par IFN et pour jouer un rôle antiviral. De plus, IKKε inhibe encore l'expression du VHC en présence d'anticorps dirigés contre les récepteurs aux IFNs, suggérant sa participation rapide à la réponse immune innée de la cellule, en plus de son rôle dans l'induction de IFN. Pour établir de façon plus physiologique le rôle d'IKKε dans la réponse cellulaire à l'infection par le VHC, nos avons analysé son niveau d'expression dans des biopsies de foie de patients infectés par le VHC. L'analyse des niveaux de RIG-I et d'autres gènes impliqués dans la voie d'induction déclenchée par RIG-I (MDA5, LGP2, Cardif, TBK1), ainsi que ceux de l'IFNβ et de deux gènes induits par IKKε ont été également inclus dans cette étude. Les résultats indiquent que l'infection par le VHC inhibe fortement les niveaux d'expression d'IKKε et de RIG-I par rapport à d'autres gènes de la voie de l'induction de l'IFNβ . Ces données soulignent l'importance de ces deux gènes dans la mise en place de la réponse immune innée. L'inhibition de leurs taux d'expression par le VHC permet d'expliquer, au moins en partie, la persistence du VHC dans l'hôte (4)

Etude de l'interaction de IKKε avec la protéine mitochondriale Cardif

En soutien de l'importance de la protéine kinase IKKε dans la réponse immune innée de l'hôte, un travail réalisé récemment en collaboration avec le groupe de J.Hiscott montre que cette kinase colocalise avec l'adaptateur mitochondrial Cardif recruté par RIG-I, ce qui n'est pas le cas pour son homologue TBK1 . Nous caractérisons actuellement les motifs de Cardif nécessaires à son interaction avec IKKε Nous recherchons également les partenaires impliqués dans la liaison IKKε Cardif par le criblage d'une banque de rate par double-hybride en levure .

(3) Lin, R., J. Lacoste, P. Nakhaei, Q. Sun, L. Yang, S. Paz, P. Wilkinson, I. Julkunen, D. Vitour, E. F. M e u r s, and J. H i s c o t t. Dissociation of a MAVS/IPS/VISA/Cardif-IKke molecular complex from the mitochondrial outer membrane by hepatitis virus C NS3/4A proteolytic cleavage. J Virol. in press

(5) Vitour, D., S. Dabo, M. VIlasco, and E. F. Meurs. in preparation

Légendes des photos :

Figure 1. Le VHC associé aux VLDL (1) se lie au récepteurSR-BI/Cla1 via VLDL (2). Les anticorps anti-SR-BI (3), VLDL (4) et anti-α lipoprotein (5) inhibent l'interaction du VHC avec SR-BI/Cla1, tandis que les anticorps anti-E2 et anti-HVR1 ne sont pas inhibiteurs(6) (voir FASEB J, Février 2006).

Figure 2. Analyse des nucléocapsides du VHC isolées à partir de sérum de patient par microscopie électronique. Les particules virales ont été adsorbées sur la grille de microscope par les anticorps anti-capside. Les nucléocapsides ont majoritairement 38-43nm de diamètre. Coloration directe avec 1% d'acétate d‘uranyle (J Virol. 75 8240-8250, 2001).

Figure 3. Localisation de la protéine de la capside du VHC dans le foie de chimpanzé au cours de l'infection expérimentale par le VHC. Immunofluorescence indirecte en utilisant un anticorps monoclonal produit par immunisation avec les nucleocapsides non-enveloppées purifiées à partir d'un sérum de patient.

(a) Coloration indirecte avec le Mab anti-capside suivie de la révélation avec des anti-IgM de souris conjugués au FITC

(b) Analyse de tissu hépatique marqué avec le Mab anti-capside par microscopie confocale (J Virol. 75 8240-8250, 2001).

Figure 4 Représentation schématique de l'attachement d'un anticorps anti-capside sur la protéine de la capside du VHC par " bipolar bridging " (pontage bipolaire)

Attachement des IgG " non-immunes " sur le site " Fcγ R-like " via le domaine Fcγ  ; Attachement des anticorps anti-capside sur la protéine de la capside par les domaines Fab et Fcγ en même temps par " bipolar brigding "

Figure 5 : Stratégie d'identification et de purification des cellules infectées par le VHC. Le facteur de transcription Gal4VP16 a été fusionné à une protéine résidente du réticulum endoplasmique via la partie centrale du motfi NS5A /5B qui est sensible à l'action de la protéase NS3/4A (Chimère ). Différents gènes rapporteurs ( CAT, GFP ou H2Kk ont été placé sous le contrôle du promoteur (Gal4)5-E1b inductible par Gal4VP16. Sous l'expression de NS3/4A, la partie Gal4VP16 de la chimère est clivée et migre au noyau où il peut induire l'expression des gènes rapporteurs. L'expression de CAT est déterminée par ELISA, celle de GFP par fluorescence ou par immunoblot. L'expression de H2Kk à la surface cellulaire est utilisée pour le tri immunomagnétique des cellules infectées par le VHC.

Figure 6 : Purification de cellules infectées par le VHC

Des cellules Huh-7 sont infectées avec une préparation de virus HCV JFH1 puis transduites le lendemain de l'infection avec des vecteurs lentiviraux HR'TRIP pseudotypés VSV exprimant les marqueurs de sélection, dont le marqueur de surface H2K κ murin. Après trois jours de culture, les cellules sont soumis à un tri immunomagnétique par AUTOMACS, basé sur l'expression de H2Kκ.Un contrôle de l'infection des cellules par le JFH1 est analysée en parallèle par un titrage des foyers viraux à l'aide d'anticorps anti-VHC provenant d'un sérum de patient.

Figure 7 : Interférence du VHC avec les voies d'induction de l'IFN.

Au cours d'une infection virale, l'induction de l'interféron par les ARNs bicaténaires est déclenchée soit par interaction de ces acides nucléiques avec la partie extracytoplasmique du récepteur Toll-like TLR3, soit à la suite de l'intrusion virale dans le cytoplasme, par interaction avec des ARNs hélicases specifiques, tel que RIG-I. Dans les deux cas, il y a activation des kinases MAPK, IKKαβγ et TBK1/IKKε , ce qui provoque l'activation des facteurs de transcription AP-1, NF-κB et IRF3, respectivement, et l'induction de l'IFNβ . En ce qui concerne l'activation par la voie TLR3, il y a recrutement de l'adaptateur TRIF par la partie intracytoplasmique de TLR3. Du point de vue de l'activation de la voie RIG-I, la liaison du domaine ARN hélicase de RIG-I avec les ARNs bicaténaires provoque un changement dans sa conformation qui permet à son domaine N-terminal CARD de s'associer avec une protéine,récemment identifiée: IPS-1/MAVS/VISA/Cardif . La particularité de cette protéine adaptatrice est de se localiser à la membrane mitochondriale . C'est cette protéine qui est responsible du recrutement des kinases et de l'activation en aval des facteurs de transcription AP-1, NF-κ B etIRF3. Le génome du VHC contient des régions ARN bicaténaires, telles que les régions 5'NTR et 3'NTR qui peuvent déclencher l'induction de l'IFNβ dés leur introduction dans la cellule hôte . Cependant, le VHC peut interférer avec l'induction de l'IFN par l'action de sa protéase NS3/4A qui peut cliver l'adaptateur TRIF et l'adaptateur IPS-1/MAVS/VISA/Cardif . Ces données soulignent l'importance de ces deux voies de signalisation d'induction de l'IFN et la nécéssité pour le virus d'inhiber ces voies afin de favoriser sa propagation.

Mots-clés: VHC, Interferon, NS3/4A, RIG-I, Cardif, IKKε, nucléocapside virale, récepteurs cellulaires, SR-BI/Cla1, récepteur Fcγ


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