Unité: Génétique Papillomavirus et Cancer humain

Responsable: Michel FAVRE

L'identification de gènes de prédisposition aux agents infectieux constitue un enjeu majeur des recherches actuelles. Nous avons identifié deux gènes (EVER1 et EVER2) de sensibilité à l'infection par les papillomavirus humains (PVH) spécifiques de l'épidermodysplasie verruciforme (EV), en particulier le PVH5 oncogène. Nos travaux ont pour objectif de comprendre la fonction des protéines EVER1 et EVER2 dans une cellule normale et dans une cellule infectée par le PVH5.

Certains PVH sont les agents de cancers du col utérin (PVH16 et PVH18), troisième cancer féminin à l'échelle mondiale, et de cancers cutanés (HPV5) observés dans l'EV, a génodermatose rare. Cette maladie résulte d'une sensibilité anormale à un groupe spécifique de PVH, dont le PVH5 qui est responsable d'infections asymptomatiques très répandues. L'EV représente notre modèle pour l'étude de la sensibilité aux PVH et pour comprendre les mécanismes génétiques mis en jeu dans la transformation maligne par les PVH oncogènes.

Nous avons précédemment identifié les gènes EVER1 et EVER2 dont des mutations sont responsables de la sensibilité au PVH5 et aux autres PVH de l'EV. Les protéines EVER pourraient être impliquées dans la permissivité des kératinocytes à l'infection par les PVH de l'EV ou dans la mise en place de la réponse immunitaire conduisant à l'élimination des lésions induites par ces virus. Notre but est de 1) caractériser la fonction des protéines EVER et de définir leur rôle au cours de l'infection virale et 2) mieux comprendre les mécanismes de la transformation maligne par le PVH5. Notre stratégie repose sur l'analyse de l'impact de l'infection par le PVH5 sur des cultures de kératinocytes de patients ou de sujets sains et sur l'identification par une technique du double hybride chez la levure des protéines cellulaires cibles des protéines EVER et des oncoprotéines E6 et E7 du PVH5.

1. Fonction(s) des protéines EVER

Nous étudions l'impact de mutations dans la protéine EVER1 ou EVER2 dans le profil d'expression de cytokines et de protéines cellulaires de lignées lymphoblastoïdes et de kératinocytes isolés de patients et de sujets sains de familles atteintes d'EV. Notre stratégie repose sur l'utilisation de puces de protéines.

2. Rôle des protéines EVER au cours de l'infection par le PVH5

Nous avons mis au point les conditions de culture de kératinocytes à partir de poils ainsi que les méthodes permettant leur différenciation in vitro. Nous avons obtenu des cultures de kératinocytes de patients atteints d'EV et de sujets sains. Ceci nous permettra d'étudier l'impact de mutations dans les gènes EVER sur les premières étapes de l'infection par le PVH5 (entrée de pseudo-particules de PVH5, transport du génome viral vers le noyau) et sur la transcription du génome viral (gènes E1, E2, E6 et E7). Les étapes tardives du cycle viral (réplication de l'ADN et production de virions) seront étudiées dans des kératinocytes en voie de différenciation (cultures en radeau).

Nous avons également montré que les protéines EVER1 et EVER2 interagissent entre elles et forment un complexe avec ZNT1, une protéine impliquée dans l'homéostase du zinc. Nous étudions actuellement le rôle des protéines EVER sur cette voie physiologique et recherchons si les oncoprotéines E6 et E7 des PVH de l'EV affectent cette voie. Des résultats préliminaires suggèrent que le complexe EVER/ZNT1 régule négativement la voie de signalisation PI3K/JNK1 activée par le zinc et que la protéine E6 du PVH5 et du PVH9 interagissent spécifiquement avec une MAP kinase de cette voie.

3. Voies de signalisation affectées par les protéines précoces des PVH oncogènes

Le but de ces recherches est de caractériser la stratégie développée par les PVH pour se multiplier et, dans le cas des PVH oncogènes, conduire à la transformation maligne des cellules infectées.

3.1. Interactome des oncoprotéines E6 et E7 du PVH5

Nous avons montré par une méthode du double hybride chez la levure que les protéines E6 et E7 du PVH5 interagissent avec des protéines des voies de signalisation du TGF-ß1 (E6), du TNF-α (E7) et du calcium (E6 et E7) et dans la régulation du cycle cellulaire (E6 et E7). Les interactions observées sont étudiées par des méthodes de biologie cellulaire (microscopie confocale, coimmunoprécipitation, "GST pull-down") et de biologie moléculaire basées sur la purification en tandem de complexes protéiques (technologie TAP-TAG) couplée à des analyses de spectrométrie de masse (technologie LC-MS/MS). L'analyse fonctionnelle de ces voies de signalisation est abordée par l'étude de l'expression d'un gène rapporteur (luciférase) sous le contrôle de promoteurs spécifiques des voies de signalisation. Nos premiers résultats ont révélé une interaction entre la protéine E6 du PVH5 et la protéine SMAD3 qui intervient dans la voie de signalisation du TGF-ß1. Cette cytokine induit la synthèse de protéines qui bloquent le passage des cellules de la phase G1 à la phase S. La levée de ce blocage par la protéine E6 pourrait constituer une étape nécessaire à la réplication de l'ADN viral. Nous cherchons actuellement à localiser le domaine d'interaction entre les protéines E6 et SMAD3 qui pourrait constituer une cible pour le développement de drogues thérapeutiques.

3.2. Interactome des protéines précoces E1, E2, E6 et E7 des PVH cutanés et génitaux oncogènes

Notre approche est basée sur l'étude comparative systématique des réseaux d'interactions entre protéines virales et cellulaires des différents génotypes de PVH oncogènes ou non oncogènes. Cette approche comporte le clonage et l'expression des phases ouvertes de lecture (ORFéome) des différents génotypes de PVH. Nous avons entrepris de déterminer par une méthode de double hybride l'interactome des protéines précoces de 11 PVH cutanés (PVH1, 3, 5, 8, 9) ou muqueux (PVH6, 11, 16, 18, 33, 39) à faible risque (PVH1, 3, 6, 9, 11) ou à haut risque (PVH5, 8, 16, 18, 33, 39) pour le développement de cancers génitaux et cutanés. Cette étude est actuellement effectuée en collaboration avec le groupe de Marc Vidal (Dana Farber Cancer Institute, Boston, USA).

4. Perspectives.

L'identification et la caractérisation de l'interactome des protéines EVER et des protéines précoces de différents génotypes de PVH devrait conduire à : 1) déterminer les fonctions des protéines EVER, 2) identifier les voies physiologiques affectées par les protéines virales et susceptibles d'être contrôlées par les protéines EVER et 3) comparer les voies de signalisation préférentiellement ou spécifiquement modifiées par les protéines des PVH à bas risque et à haut risque.

Ces études devraient permettre de mieux comprendre les stratégies virales mises en jeu dans la carcinogenèse cutanée et génitale et de définir de nouveaux moyens de lutte contre ces infections qui sont très répandues dans la population générale.

Figure 1 : Principe de la recherche de protéines cellulaires interagissant avec la protéine E6 du PVH5 par la technique du double hybride par croisement chez la levure.

Mots-clés: virologie, papillomavirus humain, cancers génitaux et cutanés, prédisposition génétique, épidermodysplasie verruciforme, gènes EVER1 et EVER2, voies de signalisation


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